HIV輔助受體CCR5常見小分子抑制劑抑制效果的綜合評(píng)價(jià)*

焦詩卉，何 淼

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

CC趨化因子受體5(CC chemokine receptor 5，CCR5)與大多數(shù)趨化因子受體一樣，屬于G蛋白偶聯(lián)受體，介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路為Gq途徑；它主要由以下幾個(gè)部分組成：胞外N末端，3個(gè)胞外環(huán)，7個(gè)跨膜區(qū)域和胞內(nèi)C末端[1]。CCR5是細(xì)胞膜上單核-巨噬細(xì)胞親和性的HIV-1輔助受體，也是β趨化因子MIP-1α、MIP-1β、RANTES等的天然受體。

艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的。在HIV 的感染過程(圖1)中，HIV與靶細(xì)胞融合，主要由包被糖蛋白gp120 和跨膜亞基gp41介導(dǎo)。gp120 與靶細(xì)胞上的CD4 分子和輔助受體(CCR5 或CXCR4)先后結(jié)合，導(dǎo)致gp41的構(gòu)型發(fā)生改變，形成6 股α-螺旋束核心結(jié)構(gòu)，將病毒包膜與靶細(xì)胞膜拉近，并發(fā)生融合，完成病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的感染過程。因此，如果能夠有效抑制CCR5的作用，就能抑制HIV進(jìn)入靶細(xì)胞，從而有效預(yù)防或治療HIV的感染。

圖1 HIV與細(xì)胞相互作用示意[2]

抑制劑的關(guān)鍵作用是抑制CCR5蛋白與gp120結(jié)合，從而有效阻礙HIV病毒進(jìn)入靶細(xì)胞。1999年，自從日本Takeda公司成功開發(fā)出第一種CCR5小分子拮抗劑—TAK-779以來，針對(duì)CCR5的小分子抑制劑研究進(jìn)展迅猛，相繼出現(xiàn)了多種TAK-779的衍生物；例如，Yao Liu(2008)等人合成了TAK-779酮衍生物，證明其能有效抑制HIV-1。2007年，由輝瑞公司研發(fā)的CCR5趨化因子受體拮抗劑馬拉韋羅(Maraviroc)成為了第一個(gè)被批準(zhǔn)上市的CCR5拮抗劑藥物。隨后，SCH-C (SCH 351125)及其衍生物SCH 350634, SCH 350581，SCH 417690(Vicriviroc)也相繼開發(fā)并應(yīng)用于臨床[3]。我國學(xué)者針對(duì)CCR5的小分子抑制劑進(jìn)行的綜述中，將目前開發(fā)并進(jìn)入臨床研究的小分子抑制劑分為7類：天然小分子類、苯并環(huán)庚烯類、哌啶類、螺環(huán)二酮哌啶類、托品烷類、4-哌啶-1-丁胺類和吡咯烷類[4]。

目前，有關(guān)CCR5常見抑制劑抑制效果的比較研究尚未見報(bào)道。本文通過構(gòu)建CCR5常見抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)模擬各種抑制劑與CCR5蛋白分子的對(duì)接模式。通過比較各抑制劑對(duì)接模式的優(yōu)劣，評(píng)估抑制劑的抑制效果；并嘗試尋找CCR5蛋白的優(yōu)化對(duì)接靶點(diǎn)，篩選CCR5的候選最優(yōu)抑制劑，為相關(guān)理論研究和藥物設(shè)計(jì)提供參考。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

CCR5蛋白三維結(jié)構(gòu)信息下載自NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白數(shù)據(jù)庫。

CCR5小分子抑制劑的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)和基本分類方法參照劉瑤等(2007)的工作[4]。本文研究對(duì)象為CCR5小分子7類的29種常見抑制劑，主要包括：天然小分子類(抑制劑1-6)、苯并環(huán)庚烯類(抑制劑7-8)、哌啶類(抑制劑9-13)、螺環(huán)二酮哌啶類(抑制劑14-16)、托品烷類(抑制劑17)、4-哌啶-1-丁胺類(抑制劑18-23)和吡咯烷類(抑制劑24-29)。

1.2 數(shù)據(jù)處理與模擬分析

1.2.1 構(gòu)建抑制劑的三維結(jié)構(gòu) 采用Accelrys公司的Material Studio 5.5(MS)軟件的Materials Visualizer模塊，構(gòu)建抑制劑的三維結(jié)構(gòu)，按照藥效團(tuán)分類輸出圖形。

1.2.2 模擬小分子抑制劑與CCR5蛋白分子對(duì)接效果 使用Discovery Studio 2.5(DS)軟件的LibDock模塊模擬小分子抑制劑與CCR5蛋白分子的對(duì)接效果，根據(jù)抑制劑與靶點(diǎn)對(duì)接時(shí)的對(duì)接模式和親和力進(jìn)行綜合打分。參數(shù)設(shè)置如下：Numbers of Hotspots為0.25；Docking Preference為User Specified; Conformation Method為BEST；Parallel Processing為True。

1.3 小分子抑制劑抑制作用評(píng)估

在分子對(duì)接的模擬過程，可以得到分子對(duì)接絕對(duì)自由能(Absolute Free Energy，記為AFE)、對(duì)接姿態(tài)數(shù)(Conf Number，記為CN)、相對(duì)自由能(Relative Free Energy，記為RFE)，以及LibDock綜合得分(LibDock Score，記為LDS)等參數(shù)值。其中，絕對(duì)自由能和相對(duì)自由能代表了該抑制劑與位點(diǎn)對(duì)接所需的能量，通常絕對(duì)自由能和相對(duì)自由能越低，表明該對(duì)接位點(diǎn)的對(duì)接越緊密，即抑制劑對(duì)該位點(diǎn)的抑制作用越強(qiáng)。對(duì)接姿態(tài)數(shù)越大，表明抑制劑與該位點(diǎn)作用的可能性越大。LibDock綜合得分是LibDock模塊綜合絕對(duì)自由能、相對(duì)自由能和對(duì)接姿態(tài)數(shù)后，對(duì)該對(duì)接姿態(tài)的綜合性打分；LibDock綜合得分越高，抑制劑對(duì)該位點(diǎn)的抑制作用越強(qiáng)。最后，利用Excel將綜合得分均值排序，分析和評(píng)估抑制劑與CCR5靶點(diǎn)相互作用效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建小分子抑制劑的三維結(jié)構(gòu)

基于MS軟件，我們分別構(gòu)建了7類抑制劑的三維結(jié)構(gòu)。初步比較發(fā)現(xiàn)，各類抑制劑之間均具有部分相似的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能是抑制劑的藥效團(tuán)，即與CCR5結(jié)合的部位。

2.2 小分子抑制劑對(duì)接位點(diǎn)與評(píng)估

研究證實(shí)，小分子抑制劑與CCR5蛋白選擇的結(jié)合位點(diǎn)主要在胞外部分[12-13]。同時(shí)，兼顧考慮到CCR5蛋白胞外N末端的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在CCR5蛋白潛在的13個(gè)可能結(jié)合位點(diǎn)中，我們縮小研究范圍，主要關(guān)注site2，site4，site6和site8等4個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(圖3)。

2.2.1 CCR5的4個(gè)可能結(jié)合位點(diǎn)與小分子抑制劑的對(duì)接結(jié)果 綜合各抑制劑對(duì)site2,4,6,8的LibDock綜合得分, 以及各抑制劑與該4個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的可能姿態(tài)數(shù)得到表1, 即各抑制劑與候選位點(diǎn)的LibDock綜合得分均值以及可能結(jié)合姿態(tài)數(shù)占總姿態(tài)數(shù)的百分比。

圖3 CCR5蛋白的4個(gè)可能結(jié)合位點(diǎn)

表1 CCR5可能的結(jié)合位點(diǎn)與小分子抑制劑結(jié)合綜合得分

在表1中，初步比較4個(gè)位點(diǎn)的LibDock綜合得分，可知Site 4的綜合得分最高，表明小分子抑制劑在該位置與CCR5蛋白結(jié)合最緊密。

分別統(tǒng)計(jì)4個(gè)位點(diǎn)所有可能的對(duì)接姿態(tài)數(shù)目占總的可能結(jié)合姿態(tài)數(shù)目的百分比(Docking Attitude Percent，記為DAP)，發(fā)現(xiàn)在site 4，對(duì)接姿態(tài)百分比達(dá)到了96.05%。因此，推斷CCR5的site 4是小分子抑制劑的主要作用位點(diǎn)，該位點(diǎn)也可能是抑制效果最優(yōu)的位點(diǎn)。

2.2.2 小分子抑制劑的抑制作用分析與評(píng)估 系統(tǒng)計(jì)算各類小分子抑制劑與CCR5的site4結(jié)合的主要參數(shù)，包括AFE、RFE、GP和LDS的均值。具體計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 各類小分子抑制劑與CCR5的site4結(jié)合的相關(guān)參數(shù)

依照LibDock綜合得分排序，抑制劑5、8、12、14、17、21和27在各自類別內(nèi)綜合得分最高。因此，這7種抑制劑對(duì)CCR5蛋白的抑制作用可能相對(duì)較強(qiáng)。比較對(duì)接姿態(tài)百分比與LibDock綜合得分2個(gè)參數(shù)值，發(fā)現(xiàn)LibDock綜合得分的高低與對(duì)接姿態(tài)百分比的大小并無直接聯(lián)系。同時(shí)，考慮對(duì)接的相對(duì)自由能和絕對(duì)自由能，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，該3個(gè)數(shù)值共同影響了LibDock的綜合得分。

在天然小分子化合物類別中，通過比較LibDock綜合得分，初步得到該類別抑制劑的排序，即：抑制劑5>抑制劑1>抑制劑4>抑制劑6>抑制劑3>抑制劑2。Yoganathan等(2003)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論發(fā)現(xiàn)，甲氧基二氫暗褐菌素(抑制劑1)、暗褐菌素(抑制劑2)和Fuscinarin(抑制劑3)對(duì)CCR5蛋白抑制的 IC50值分別為154、21和80 μmol/L[5]，支持了我們的結(jié)論。該IC50值可以表示化合物對(duì)CCR5蛋白的抑制作用, 因此該值越大,表明對(duì)CCR5蛋白的抑制作用越強(qiáng)。

另一部分學(xué)者研究抑制劑對(duì)[125I]-RANTE與表達(dá)CCR5的中國倉鼠細(xì)胞(CHO) IC50值,該值表明了化合物對(duì)RANTE的抑制作用,因此數(shù)值越大,對(duì)RANTE的抑制作用越強(qiáng),并對(duì)CCR5的抑制作用越弱。根據(jù)他們的研究，研究發(fā)現(xiàn)Sch351125(抑制劑9)對(duì)[125I]-RANTE與表達(dá)CCR5的中國倉鼠細(xì)胞(CHO)的IC50值為9.0 nmol/L[6]；Sch417690(抑制劑12)的抗病毒活性要比Sch351125(抑制劑9)高近10倍，其對(duì)R5型HIV-1的IC50值為0.1～3 nmol/L[7]。Wood A等[8]研發(fā)了進(jìn)入臨床Ⅲ期的小分子抑制劑UK-427857(抑制17)，可以有效阻斷 [125I]-RANTE與CCR5的結(jié)合，其IC50值為7.18 nmol/L。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了計(jì)算得到抑制劑的抑制效果排序的結(jié)論，即：抑制劑12>抑制劑17>抑制劑9。

此外，默克公司研制的1,3,4-三取代吡咯烷化合物(抑制劑24)，其抗CCR5的IC50值為26 nmol/L。根據(jù)該類化合物改進(jìn)獲得的抑制劑28和29，其IC50值分別為0.13和2.5 nmol/L[9]。同樣支持了關(guān)于吡咯烷類化合物抑制效果排序的計(jì)算推斷，即：抑制劑28>抑制劑29>抑制劑24。

2.2.3 候選抑制劑與site 4對(duì)接效果模擬 基于Discovery Studio軟件，可以獲得抑制劑與CCR5蛋白對(duì)接的結(jié)果，放大對(duì)接位點(diǎn)，去掉未與位點(diǎn)結(jié)合的分子，分析與位點(diǎn)結(jié)合的分子個(gè)數(shù)，以及所占的位點(diǎn)面積(圖4)。

初步比較發(fā)現(xiàn)，抑制劑8(圖4B)與site4的結(jié)合區(qū)域明顯大于其它抑制劑。按照結(jié)合區(qū)域的大小排序，依次為抑制劑14(圖4D)、抑制劑27(圖4G)、抑制劑21(圖4F)、抑制劑12(圖4C)、抑制劑5(圖4A)和抑制劑17(圖4E)。

但是，基于LibDock綜合得分得出的抑制劑效果排序?yàn)椋阂种苿?7>抑制劑8>抑制劑12>抑制劑14>抑制劑21>抑制劑5>抑制劑17。兩種方式獲得排序不完全一致，表明結(jié)合區(qū)域的大小與抑制劑的抑制效果不完全具有正相關(guān)關(guān)系?？赡苁墙Y(jié)合部位的分子類型或分子結(jié)構(gòu)會(huì)影響到LibDock綜合得分。

圖4 抑制劑5、8、12、14、17、21和27分別與site4結(jié)合姿態(tài)放大圖

3 討 論

CCR5是目前治療HIV-1的新型靶點(diǎn)，有效抑制CCR5便能夠有效控制HIV-1病毒感染細(xì)胞。目前，國際上針對(duì)CCR5抑制劑的研究倍受關(guān)注。本文利用Accelrys公司的軟件Discovery Studio的LibDock模塊成功模擬了小分子抑制劑與CCR5蛋白的對(duì)接，計(jì)算推測(cè)了抑制劑的抑制效果排序，模擬了對(duì)接效果，為進(jìn)一步藥物開發(fā)和臨床使用提供了參考。

計(jì)算分析得到了抑制劑的抑制效果排序，即：抑制劑27>抑制劑8>抑制劑12>抑制劑14>抑制劑21>抑制劑5>抑制劑17；并且，初步發(fā)現(xiàn)CCR5蛋白與小分子抑制劑結(jié)合的位置可能主要在第二個(gè)胞外環(huán)。因此，未來的小分子抑制劑的開發(fā)應(yīng)著眼于CCR5的第二個(gè)胞外環(huán)，對(duì)哌啶類的抑制劑27進(jìn)行修飾可能會(huì)發(fā)現(xiàn)具有更強(qiáng)抑制效果的抑制劑。

然而，相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吡啶類生物堿anibamine的三氟醋酸鹽(抑制劑6)，蛇胞菌素c(抑制劑4) 和19,20-環(huán)氧松胞菌素Q(抑制劑5)對(duì)CCR5的抑制效果，獲得的IC50值分別為1、40和60 μmol/L[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算推測(cè)結(jié)論：抑制劑4>抑制劑5>抑制劑6，并不完全符合。可能的原因是，軟件設(shè)計(jì)中未考慮到蛋白與小分子抑制劑在對(duì)接時(shí)可能發(fā)生構(gòu)象的改變。

另外，TAK-220 (抑制劑23)具有很好的CCR5拮抗作用，IC50值3.5 μmol/L；它可以與CCR5上的第4、5、6跨膜區(qū)結(jié)合[11]，這與實(shí)驗(yàn)的結(jié)論有所不同?？赡艿脑蛟谟冢疚姆治隽伺c大多數(shù)抑制劑結(jié)合的CCR5第二個(gè)胞外環(huán)，而TAK-220是一個(gè)較特殊的抑制劑，與大多數(shù)小分子抑制劑結(jié)構(gòu)差異較大，這可能是導(dǎo)致抑制劑23抑制作用較低的一個(gè)重要原因。

雖然小分子抑制劑對(duì)CCR5具有很強(qiáng)的抑制作用，但是，它們易造成抗性的產(chǎn)生，導(dǎo)致拮抗劑的功能下降或喪失。通常小分子抑制劑只能作用于CCR5的單個(gè)位點(diǎn)，而多肽抑制劑則能夠與CCR5蛋白相互作用，從而結(jié)合多個(gè)位點(diǎn)。因此，多肽抑制劑具有更高的臨床意義，這也可能是未來CCR5拮抗劑開發(fā)的方向。

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