水產養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境細菌鑒定及抗生素抗性基因檢測*

黃志堅，陳旭凌，路曉峰，鐘立洪，何建國

(中山大學海洋學院，廣東 廣州 510275)

抗生素是用于治療各種細菌感染或抑制致病微生物感染的藥物。長期以來，抗生素在人類生活與生產中，都起到了至關重要的作用，但重復使用一種抗生素可能會使致病菌產生抗藥性。ARGs作為一種新型環(huán)境污染物被Pruden等[1]提取出來以后，有關的研究報道就屢見不鮮。近年來，抗生素的過度使用衍生出了“超級細菌”等危及到人類健康的問題，細菌中抗性基因檢出率不斷增加[2]?？股氐氖褂门c抗性基因的存在之間的相關性，引起了人們的廣泛關注[3-5]?？股乜剐曰?ARGs)已經成為了21 世紀威脅人類健康的最重大挑戰(zhàn)之一[6]。

我國是世界第一水產養(yǎng)殖大國，細菌性病害在水產養(yǎng)殖中影響非常嚴重，特別是在密集型養(yǎng)殖系統中，發(fā)生更為頻繁，極大地限制了我國水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[7-8]。針對水產養(yǎng)殖業(yè)大量使用抗生素這一現狀，開展?jié)O業(yè)環(huán)境抗生素抗性基因污染的研究，建立水產養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境抗生素抗性菌株篩選和鑒定方法，揭示抗生素抗性基因在漁業(yè)環(huán)境中的擴散和傳播規(guī)律，對于評價抗生素抗性基因的生態(tài)風險十分必要。不僅能確保我國水產養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，而且對于我國的生態(tài)安全和經濟發(fā)展具有重要的現實意義。

本文采用改進的煮沸法，設計快速提取DNA的方法，鑒定水產養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中細菌的種屬，同時進行抗性基因攜帶情況的檢測，可針對水產養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中的細菌設計有效抑制細菌的抗生素藥物，進行科學合理的運用，有利于細菌耐藥基因機制的研究，開發(fā)非抗生素類抑菌化合物。

1 材料與方法

1.1 樣品采集、處理及保存

細菌樣品于2010年3月至2012年4月采集于湛江、珠海、湖南、海南等地的水產養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境。將初步處理的樣品涂布于2216E或LB瓊脂培養(yǎng)基，進行分離純化以形成單菌落。將分離純化好的菌株編號，加入終體積分數為20%～30%的甘油，-80 ℃保存。

1.2 DNA的提取

對煮沸法進行改進，設計出一種快速提取DNA的方法[9]。將純化好的細菌接種于2216E或LB培養(yǎng)液中，隔夜搖床培養(yǎng)。用吸管吸取1 mL的細菌培養(yǎng)液，7 500 r/min離心5 min，棄掉上清，加入0.4 mL的無菌水，振蕩搖勻后，沸水浴煮10 min，然后再12 000 r/min離心10 min，上清液即可作為DNA模板，-20 ℃保存。

1.3 菌種的鑒定

1.3.1 菌種16S rDNA的擴增 取制備的樣品DNA模板液，選取上游引物Eubac 27f：AGA GTT GAT CCT GGC TCA G，下游引物Eubac 1492r：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T(引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成)，進行16S rDNA的PCR擴增。

PCR反應體系為50 μL，內含2 × PCR Reaction Mix 25 μL、10 μmol/L的引物27f和引物1492r各2 μL、2.5 U的Taq酶0.5 μL、含50～150 ng的DNA模板溶液2 μL、ddH2O 18.5 μL。

擴增條件為：94 ℃預變性5 min，然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)，最后72 ℃充分延伸10 min。擴增產物用w=1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小、純度及亮度，目的條帶約為1.5 kb。

1.3.2 序列的測定及比對 PCR擴增產物，直接委托公司進行雙向測序，測序引物為擴增引物27f/1492r，序列分析儀為ABI 3730型全自動DNA測序儀。測序結果與GenBank 數據庫中目的基因序列比對，以確定菌株的種屬。

1.4 抗生素抗性基因(ARGs)的定性分析

1.4.1 ARGs的擴增與檢測 取制備的樣品DNA模板液，參照文獻[5-7]設計氟氯霉素抗性基因(floR)、磺胺類抗性基因(sul1、sul2)、鏈霉素抗性基因(str)及甲氧芐啶抗性基因(dfrA20)抗生素抗性基因引物[8]。擴增條件為：92 ℃預變性5 min，然后98 ℃變性10 s，52～55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30～60 s，共30個循環(huán)，最后在72 ℃充分延伸7 min。擴增產物用w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小。

1.4.2 序列的測定及比對 PCR擴增產物，直接委托華大基因進行測序，測序結果與GenBank 數據庫中目的基因序列比對，以確定為對應的抗性基因序列。

2 結果與分析

2.1 菌種的鑒定

共分離純化194株細菌菌株，PCR擴增菌株16S rDNA基因，均能獲得單一的目的DNA片段，目的條帶清晰，明亮，特異性擴增產物大小為1.5 kb左右(見圖1)。經測序及與GenBank上同源序列比對，同源性高，分別屬于62種不同種屬，主要以賴氨酸芽孢桿菌、副溶血性弧菌、中間氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、蠟樣芽孢桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、金黃桿菌、假交替單胞菌、霍亂弧菌為主，這10種細菌共占了56.2%。

圖1 細菌16S rDNA基因的PCR擴增電泳圖

2.2 抗生素抗性基因(ARGs)的定性分析

選取其中的139株菌進行抗生素抗性基因檢測，各抗性基因PCR擴增電泳圖見圖2，PCR 定性結果為陽性，片斷大小正確，初步證明樣品中含有目的基因，將PCR 產物基因測序結果與基因庫中目的基因序列比對，進一步證實為目的基因。其中含有至少一種抗性基因的菌株有43株，以副溶血性弧菌、中間氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、弗氏檸檬酸桿菌、類產堿假單胞菌含抗性基因為主(見表1)。139株細菌中，16株floR基因擴增結果呈陽性，29株sul1基因擴增結果呈陽性，17株sul2基因擴增結果呈陽性，14株str基因擴增結果呈陽性，4株dfrA20基因擴增結果呈陽性，空白對照結果均為陰性。各抗性基因檢出率如表2所示。

圖2 floR、str、sul1、sul2和dfrA20基因的PCR擴增電泳圖

表1 細菌抗性基因檢測結果1)

表2 各抗性基因檢出率

3 討 論

近年來，抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的大量使用，使水產養(yǎng)殖生物和養(yǎng)殖環(huán)境中的細菌可能含有一種或多種抗性基因，從而導致耐藥性的產生。研究發(fā)現ARGs能夠由染色體、質粒、轉座子、整合子和基因盒、插入序列共同區(qū)介導[10]，在細菌之間傳播，進而在環(huán)境中擴散，對公共健康和食品安全構成嚴重的威脅。

本研究中抗性基因的檢出率相對比較高，其中編碼磺胺類的抗性基因的檢出率sul1>sul2，與Hoa P T P等[11]在越南北部的城市運河、養(yǎng)魚池、養(yǎng)蝦池也發(fā)現了編碼磺胺類的抗性基因檢出率sul1>sul2，兩者的趨勢一致。黃金偉等[12]在對嗜麥芽窄食單胞菌中，發(fā)現sul1由Ⅰ類整合子介導，是Ⅰ類整合子的一部分。Barbolla等[13]研究31株細菌中3株表現為對復方磺胺甲噁唑高MIC，同時擴增出Ⅰ類整合子基因和sul1基因，在敏感的細菌中均未檢測到；Toleman M A等[14]進一步研究發(fā)現sul2在大的質粒上，但少部分也可以由染色體介導，sul2與ISCR插入元件共同區(qū)(insertion element common region，ISCR)連鎖，該研究數據表明Ⅰ類整合子以及ISCR元件與sul2基因的連鎖能夠介導嗜麥芽窄食單胞菌對復方磺胺甲噁唑的耐藥性，sul1、sul2基因的存在與磺胺類藥物耐藥有直接關系，并且整合子——ISCR結構可以更容易地把幾個耐藥基因一起從一個質粒整合到另一個質粒或染色體上，增加耐藥性傳播。

抗生素抗性基因的檢出可以證明細菌的耐藥性，闡釋細菌耐藥機理，更可以檢查耐藥因子的起源及傳播擴散途徑和動態(tài)，為耐藥細菌，尤其是耐藥病原菌的追蹤監(jiān)測提供其它方法無法取代的最佳手段。利用現代分子生物學技術測定耐藥基因的核酸序列還可用來檢測耐藥基因的變異，用來追蹤某一耐藥基因的系統發(fā)生和進化演化，并通過計算機分子結構建模而預測該耐藥基因表達產物耐藥譜的演化。本研究將在檢測抗性基因的基礎上進一步開展耐藥機制的研究。

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