N-磷?；喟桶放c牛胰島素弱相互作用的ESI-MS研究*

韓國勝，馮 聰，王 珍，廖新成，武現(xiàn)麗

(鄭州大學(xué)化學(xué)系∥河南省化學(xué)生物學(xué)與有機(jī)化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001)

神經(jīng)傳質(zhì)物質(zhì)多巴胺(DA)是由酪氨酸衍生而來，是繼腎上腺素和去甲腎上腺素后第3種內(nèi)源性兒茶酚胺，在體內(nèi)為合成去甲腎上腺素的前體。不同劑量的多巴胺具有不同的藥理特性，至今仍是治療心力衰竭和休克的重要藥物，被廣泛應(yīng)用于臨床[1]。但多巴胺半衰期短、作用時(shí)間短，只能靜注，應(yīng)用范圍受到一定的限制。近年來，對多巴胺副作用的報(bào)道逐漸增多：如最新的臨床研究表明[2]，小劑量多巴胺(LDD)不僅對腎臟功能沒有保護(hù)作用，而且對重癥患者的內(nèi)分泌、消化和呼吸系統(tǒng)都有不同程度的不良影響。因此，尋找體內(nèi)半衰期長、生物利用度高、活性強(qiáng)和毒副性小的多巴胺類新型藥物是一個(gè)重要的研究方向。對原有藥物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾是提高其各種性能的一種有效途徑。磷酸酯常被用作前藥來增加藥物的水溶性進(jìn)而提高它的生物利用率，因此對多巴胺進(jìn)行磷?；歉纳破渖锘钚缘囊环N方式，因?yàn)榱姿峄鶊F(tuán)的引入可以改變其母體分子的某些物理和化學(xué)性質(zhì)，增加或減弱分子間相互作用。在前期工作中合成了6種磷?；喟桶奉惢衔颷3]，其結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 6種N-磷?；喟桶返幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)

藥物小分子與蛋白質(zhì)結(jié)合是藥物在機(jī)體內(nèi)的一種特殊的分布與儲(chǔ)備形式，這種結(jié)合對于藥物的作用強(qiáng)度與作用時(shí)間以及體內(nèi)代謝與排泄過程都有重要影響[4]。目前，電噴霧離子肼-質(zhì)譜(Electrospray Ionization-Mass Spectrometry, ESI-MS)以其在研究生理?xiàng)l件下蛋白與藥物非共價(jià)結(jié)合所具有的分析速度快、靈敏度高及樣品消耗量少等特點(diǎn)，已被成功地用于測定溶液中小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)間非共價(jià)結(jié)合的化學(xué)計(jì)量和解離常數(shù)[5-7]。

本文通過ESI-MS方式對所合成的6種N-磷酰化多巴胺分子與牛胰島素的弱相互作用進(jìn)行研究，比較了N-磷酰化多巴胺的不同結(jié)構(gòu)對他們與蛋白相互作用的影響，初步探討了其構(gòu)效關(guān)系。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Bruker-Esquire-3000 電噴霧-離子阱多級質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics Gmbh, Germany)，檢測范圍m/z915～2 500；進(jìn)樣泵：Cole-Parmer 74900 syringe pump Cole Parmer 儀器公司。

1.2 主要材料與試劑

胰島素購于Sigma化學(xué)試劑公司，未經(jīng)進(jìn)一步純化直接使用；甲醇為色譜純；醋酸為分析純；水為純水機(jī)(美國LABCONCO公司)生產(chǎn)的超純水。

1.3 質(zhì)譜條件

采用正離子檢測模式，噴霧氣(N2)壓力82.76 kPa，干燥氣(N2)流速7.5 L/min，毛細(xì)管電壓4 000 V，毛細(xì)管溫度200 ℃，樣品導(dǎo)入離子源速率4 μL/min；混合溶液配制后，孵育一周進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 磷?；喟桶放c牛胰島素的弱相互作用

牛胰島素(Insulin from bovine pancreas，C254H377N65O75S6，相對分子質(zhì)量為5 733.50)是機(jī)體內(nèi)唯一降低血糖的激素，也是唯一同時(shí)促進(jìn)糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。它是一條由21個(gè)氨基酸組成的A鏈和另一條由30個(gè)氨基酸組成的B鏈，通過兩對二硫鏈連結(jié)而成的一個(gè)雙鏈兩性蛋白質(zhì)分子，而且A鏈本身還有一對二硫鍵組成，可以作為一種模型用于研究蛋白的空間構(gòu)象、酶動(dòng)力學(xué)以及分子進(jìn)化、分子免疫間的關(guān)系[8]。近年來，關(guān)于溶菌酶與外源性分子相互作用的研究有些報(bào)道，陳曉嵐等[9-10]曾通過ESI-MS和熒光光譜法對7-羥基黃酮、5,7-二羥基黃酮及其磷?；a(chǎn)物與溶菌酶的相互作用進(jìn)行過研究；其課題組還研究了柚皮素、柚皮苷、芹菜素、木犀草素、大豆苷元磷?；苌铩㈤纹に?、N-磷?；孽ゼ靶‰摹⒘柞；喟桶返扰c溶菌酶的相互作用[11-15]。而以雙螺旋結(jié)構(gòu)的牛胰島素與外源性分子相互作用的研究卻鮮見報(bào)道，本文通過研究N-磷?；喟桶放c其相互作用來初步考察所合成小分子的生理活性。

因?yàn)闄C(jī)體pH值近中性，本實(shí)驗(yàn)選擇近中性的溶液環(huán)境來研究N-磷?；喟桶放c牛胰島素的弱相互作用。作為對照，首先用ESI檢測了流動(dòng)注射的牛胰島素溶液，此溶液由等體積的甲醇和0.04 mol/L胰島素的φ=0.5%醋酸水溶液混合而成，圖2顯示了牛胰島素從[M+3H]3+到[M+6H]6+的多電荷分布狀態(tài)，并且以(M+4H)4+峰值最高。圖2中所計(jì)算的平均相對分子質(zhì)量為5 733，與事實(shí)相符。

圖2 牛胰島素ESI-MS圖

蛋白質(zhì)分子能夠根據(jù)自身所處環(huán)境的微小變化，自發(fā)的進(jìn)行分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變是體現(xiàn)蛋白質(zhì)生理活性的重要特征。蛋白質(zhì)多電荷的特性為質(zhì)核比大小、絕對電荷的多少、多電荷分布的相對豐度，都跟溶液中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)像有關(guān)。如果蛋白質(zhì)的多電荷分布朝著低質(zhì)核比和高電荷方向移動(dòng)，這就和蛋白質(zhì)更為“敞開”、“伸展”的構(gòu)象相對應(yīng)[16-17]。比較圖 2和圖 3中胰島素的多電荷峰，可以看出各環(huán)境中胰島素均以[M+4H]4+峰值為最高，但圖 3中沒有檢測到[M+6H]6+峰，[M+5H]5+峰相對豐度也明顯下降，[M+4H]4+峰強(qiáng)度占絕對優(yōu)勢，這表明蛋白質(zhì)的多電荷分布朝著高核質(zhì)比和低電荷方向移動(dòng)了，說明加入化合物a,b,c,d,e,f后，胰島素在溶液中的構(gòu)象均趨于收縮。

比較圖3的各個(gè)小圖，可以看到隨著磷上烷氧取代基鏈增長低電荷和高核質(zhì)比的峰豐度增強(qiáng)，而高電荷低核質(zhì)比的峰豐度減弱?；衔颽、b、c和e相比磷上烷氧基的烷基取代基分別是碳原子數(shù)為1、2、3和4的直鏈烷基，比較它們的質(zhì)譜圖可以看到[M+5H]5+峰的相對強(qiáng)度逐漸減弱，而帶4個(gè)電核的[M+4H]4+峰及其與底物形成的復(fù)合物峰的總強(qiáng)度是逐漸增加的，由此可以推斷磷上的烷氧取代基上脂肪鏈越長胰島素在溶液中的構(gòu)象越趨于收縮。這可能是因?yàn)槿〈鲩L分子的空間結(jié)構(gòu)較為伸展，分子柔順性和疏水性增加，使胰島素分子在溶液中的構(gòu)象更加收縮?；衔颿和d相比，磷?；系耐檠跞〈现炬溇?個(gè)碳原子，c是丙基取代而d是異丙基取代，對比圖3c和3d二者相差不大。再比較化合物e和f也可以得到同樣的結(jié)論，說明當(dāng)取代基的碳原子數(shù)相同時(shí)，支鏈或直鏈結(jié)構(gòu)對胰島素的空間構(gòu)象影響程度差別不大。

從圖3可以看到圖中除了胰島素的多電荷峰以外，出現(xiàn)了一些新的離子峰，它們分別對應(yīng)于帶不同電荷的胰島素結(jié)合不同個(gè)數(shù)的N-磷酰化多巴胺所形成復(fù)合物。由圖3a可知，所帶電荷數(shù)為4和5的胰島素分子容易和化合物a結(jié)合形成復(fù)合物，能夠檢測到化學(xué)計(jì)量數(shù)均為1∶1的復(fù)合物，說明胰島素和化合物a能夠發(fā)生弱相互作用。由圖3b可以看到只有所帶電荷為4的胰島素分子能夠與化合物b形成化學(xué)計(jì)量數(shù)為1∶1和1∶2的復(fù)合物。為了比較6種不同的底物與胰島素所形成的復(fù)合物所帶電荷數(shù)和計(jì)量比，將上述6種化合物與牛胰島素形成的帶不同電荷的復(fù)合物的不同化學(xué)計(jì)量比匯總于表1中。 表 1數(shù)據(jù)表明胰島素和6種化合物最容易形成帶4個(gè)正電荷的復(fù)合物，均沒有出現(xiàn)帶3和6個(gè)電荷的復(fù)合物， 也只有化合物a和f出現(xiàn)帶5個(gè)電荷的復(fù)合物。這是因?yàn)檫@6種化合物也對胰島素在溶液中構(gòu)象有一定影響，當(dāng)胰島素溶液中加入這類化合物時(shí)胰島素的[M+6H]6+峰消失，[M+5H]5+峰的強(qiáng)度大大減弱，其減弱程度與底物小分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。對比化合物c和d及e和f的結(jié)構(gòu)，可以看到當(dāng)取代基碳原子數(shù)相同時(shí)支鏈結(jié)構(gòu)更容易與胰島素形成高計(jì)量比的復(fù)合物；比較化合物a、b、c、e與胰島素形成的復(fù)合物計(jì)量比可以看到當(dāng)烷基取代基碳鏈越長時(shí)越容易形成高計(jì)量比的復(fù)合物。這可能因?yàn)樘兼湹拈L短及碳原子的排列順序與分子的柔順性和疏水性及空間位阻有關(guān)。從表1中可以看到復(fù)合物中底物與胰島素的最高化學(xué)計(jì)量比為5∶1。

圖3 牛胰島素與6種化合物的混合溶液的ESI-MS圖

表1 N-磷?；喟桶放c胰島素形成復(fù)合物的計(jì)量比及電荷數(shù)

2.2 N-磷?；喟桶放c牛胰島素復(fù)合物的穩(wěn)定性研究

這些復(fù)合物是靠磷酰化多巴胺和牛胰島素的弱相互作用形成的，在電噴霧離子阱質(zhì)譜中它們具有一定的耐碰撞能力。當(dāng)升高儀器的錐空電壓(毛細(xì)管輸出電壓)時(shí)，帶電粒子之間以及與溶劑分子、惰性氣體分子之間的碰撞幾率增大，因此有些復(fù)合物會(huì)發(fā)生解離，導(dǎo)致復(fù)合物的豐度降低。當(dāng)錐空電壓升高到一定值時(shí)，這些復(fù)合物就會(huì)消失，不同磷?；喟桶泛鸵葝u素形成的復(fù)合物具有不同的耐碰撞能力，即復(fù)合物消失時(shí)(其信號強(qiáng)度在儀器信噪比3倍以下)，它們的最高錐空電壓是不同的，據(jù)此可以比較不同復(fù)合物的相對穩(wěn)定性[13,16,18]。 測定各種磷酰化多巴胺與復(fù)合物的最高錐空電壓如表2所示。

表2 N-磷?；喟桶放c胰島素形成復(fù)合物的最高耐受電壓

從表 2數(shù)據(jù)可以看出，磷?；喟桶飞狭咨贤檠趸耐榛兼溤介L，最高錐空電壓越高；比較化合物a、b、c和e與胰島素形成的復(fù)合物的分解電壓，可以看到磷原子上烷氧取代基的直鏈烷基每增加一個(gè)碳原子最高錐空電壓增加3～9 V左右，說明直鏈取代基的增長有利于增強(qiáng)底物與胰島素之間的相互作用力，這可能是因?yàn)槿〈介L分子的柔性越強(qiáng)，分子越容易變形，越有利于二者的相互作用。比較化合物c和d、e和f與胰島素形成的復(fù)合物的最高分解電壓可以看到，當(dāng)取代基上碳原子數(shù)相等時(shí)，支鏈取代產(chǎn)物與直鏈取代產(chǎn)物與胰島素形成的復(fù)合物相比，其最高錐空電壓要低10 V多，這可能是因?yàn)橹ф溔〈鷷r(shí)分子的空間位阻大，不利于二者的有效結(jié)合，減弱了其結(jié)合力。

3 結(jié) 論

上述系列N-磷?；喟桶肪膳c牛胰島素在質(zhì)譜條件下形成復(fù)合物，不同結(jié)構(gòu)的磷?；喟桶放c胰島素形成復(fù)合物的個(gè)數(shù)、電荷分布和穩(wěn)定性不同，而且對蛋白質(zhì)在溶液中的構(gòu)象有不同影響。磷上烷氧基中脂肪鏈的長短和碳原子排列順序是主要影響因素。碳鏈越長越容易形成高計(jì)量比的復(fù)合物，胰島素在溶液中的收縮程度越高；碳鏈越長小分子與胰島素形成的復(fù)合物越穩(wěn)定；但當(dāng)碳原子數(shù)相同時(shí)因支鏈取代基的位阻增大而消弱了底物與蛋白質(zhì)之間的相互作用。本結(jié)論為新型多巴胺類藥物分子的設(shè)計(jì)和開發(fā)具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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