高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中8種合成著色劑

楊 嵐，張敬軒，李 強(qiáng)，吳春敏，李建文

（河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050091）

人工合成著色劑被廣泛應(yīng)用于飲料、雪糕、糖果、糕點(diǎn)、蜜餞、果凍、果醬、調(diào)料、火腿、罐頭等食品。人工合成著色劑屬于偶氮染料，具有一定毒性，若使用不當(dāng)會(huì)危害人體健康，我國(guó)對(duì)其在食品中的使用有嚴(yán)格限制與規(guī)定，多種合成著色劑已被禁止或嚴(yán)格限量使用［1］。但是，在經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，我國(guó)食品中人工合成著色劑的超標(biāo)、超范圍使用現(xiàn)象屢禁不止，因此，建立快速、準(zhǔn)確、靈敏的人工合成著色劑檢測(cè)方法勢(shì)在必行。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中的高效液相色譜法［2］是較好的檢測(cè)方法，但其推薦的樣品前處理技術(shù)是色素的吸附與解吸附方法，步驟繁瑣，易造成損失［3］。本文采用快速液相色譜、DAD多波長(zhǎng)檢測(cè)法，不僅縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了靈敏度，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，而且大大簡(jiǎn)化了前處理方法［4］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬黃、日落黃（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；莧菜紅、胭脂紅、亮藍(lán)（國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）；誘惑紅、赤蘚紅（天津市衛(wèi)生防病中心研制）；甲醇為色譜純；乙酸銨為優(yōu)級(jí)純；乙醇、氨水均為分析純。

乙醇－氨水溶液：將80mL乙醇和1mL的氨水加超純水定容于100mL的容量瓶配置而成。

8種著色劑混合標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：100μg／mL。準(zhǔn)確量取適量的每種著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋成100 μg／mL的8種著色劑混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4℃保存，有效期1個(gè)月）。

樣品（果汁、果味飲料、山楂糕、方便面、餅干、掛面）均為市場(chǎng)銷售的實(shí)際樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜（美國(guó)Agilent公司）；內(nèi)附自動(dòng)進(jìn)樣器、二元泵、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；RT15T高速冷凍離心機(jī)（上海天美公司）；AB 265十萬(wàn)分之一分析天平（法國(guó)Mettler公司）；超聲波清洗器（KQ－250pv）；移液器（200μL，1mL，5mL）；一次性注射式濾器（配有0.22μm微孔濾膜）。

1.3 色譜條件

色譜柱：Warters－C18，（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相梯度洗脫條件見(jiàn)表1，其中A為甲醇；B為10mmol乙酸銨（加入200μl冰乙酸）；流速：1.00mL／min；進(jìn)樣量：10.00μL；柱溫：室溫。以甲醇－乙酸銨水溶液為流動(dòng)相。

表1 梯度洗脫程序

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的確定

將8種著色劑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋為1.00μg／mL、2.00μg／mL、4.00μg／mL、6.00μg／mL、8.00μg／mL、10.0μg／mL、20.0μg／mL、30.00μg／mL、40.00μg／mL、50.00μg／mL，并在上述色譜條件下測(cè)定，得到各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.5 樣品前處理

選取6個(gè)有代表性的樣品：果汁、果味飲料、山楂糕、方便面、餅干、掛面。

稱取1.0g左右固體樣品于10mL離心管中，加5ml乙醇－氨水－水溶液，超聲提取30min，15000r／min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾后，供HPLC測(cè)定。

吸取1mL液體樣品于10mL離心管中，加4mL乙醇－氨水－水溶液，超聲提取30min，15000r／min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)膜過(guò)濾后，供HPLC測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

以甲醇和乙酸銨溶液為流動(dòng)相，比較了不同濃度配比、不同pH、不同梯度洗脫的各種條件下考察了各種因素對(duì)于目標(biāo)化合物的分離度、峰形的影響。最終采用如表1所示梯度洗脫程序效果最好，在該條件下分離8種質(zhì)量濃度均為50mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)品，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 8種標(biāo)品在質(zhì)量濃度為50mg／L時(shí)的分離色譜圖

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

使用DAD檢測(cè)器分別對(duì)檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)、酸性橙、赤蘚紅進(jìn)行光譜掃描，根據(jù)所得光譜圖可知，大部分合成著色劑在低于250nm處都有較大吸收，但低波長(zhǎng)區(qū)域往往會(huì)有其它物質(zhì)的干擾，因此選擇254nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，但是，亮藍(lán)在254nm處吸收低，因此，同時(shí)采用其最大吸收波長(zhǎng)629 nm作為亮藍(lán)的檢測(cè)波長(zhǎng)。最終確定檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、酸性橙、赤蘚紅的檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。亮藍(lán)的檢測(cè)波長(zhǎng)為629nm。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

合成著色劑屬于水溶性化合物，因此提取溶劑應(yīng)該使用極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑和水混合溶劑。通過(guò)對(duì)樣品使用水及不同比例乙醇－氨水水溶液提取測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇∶氨水∶水比例為80∶1∶19時(shí)，提取效率較高，而且減少了有機(jī)溶劑的用量，最終確定乙醇∶氨水∶水比例為（80∶1∶19）水溶液為提取溶劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，并配制成一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合液，在所選定的色譜條件下，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。方法的檢出限以RSN＝3計(jì)算。各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見(jiàn)表2。從結(jié)果可以看出，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998，方法檢出限介于0.0502～0.6119μg／mL之間。

表2 方法線性方程和檢出限

2.5 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

取山楂空白樣品作為平行試樣進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，分別添加2個(gè)水平的等量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5節(jié)處理進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平做6個(gè)平行，8種合成著色劑的回收率范圍在85.4%～99.3%之間，RSD范圍在1.36%～3.89%之間。實(shí)驗(yàn)的加標(biāo)回收率及精密度見(jiàn)表3。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

本方法用于市場(chǎng)銷售的實(shí)際樣品（果汁、果味飲料、山楂糕、方便面、餅干、掛面）測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示果味飲料中含有日落黃著色劑，掛面中含有檸檬黃和赤蘚紅著色劑，果汁、山楂糕、方便面、餅干中均未檢測(cè)出含有這8種著色劑。

果汁

果味飲料

山楂糕

方便面

圖2 實(shí)際樣品測(cè)定色譜圖

3 結(jié)論

上述結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確，靈敏度高、精密度好、準(zhǔn)確度高。8種合成著色劑的檢出限為0.0502～0.6119μg／mL，加標(biāo)回收率范圍在85.4%～99.3% 之間，RSD（n＝6）范圍在1.36%～3.89% 之間。該方法不需濃縮、前處理簡(jiǎn)便、試劑用量少，采用254nm、629nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，干擾物質(zhì)少，從樣品處理到上機(jī)測(cè)定僅需2h即可完成，符合現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。

［1］ 姚煥章.食品添加劑［M］.北京：中國(guó)物資出版社，2001.

［2］ GB／T5009.35－2003食品中合成著色素劑的測(cè)定［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［3］ 李娜.快速液相色譜法測(cè)定食品中11種合成著色劑［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（1）：313－325.

［4］ 沈小婉.色譜法在食品分析中的應(yīng)用 ［M］.北京：北京大學(xué)出版社，1992.