慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細(xì)胞亞群變化與血清HBV DNA水平分析

王 慰，鄭歡偉，員美娜，任桂芳，李兵順*

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院感染二科，河北石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，河北石家莊050017）

慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細(xì)胞亞群變化與血清HBV DNA水平分析

王 慰1，鄭歡偉1，員美娜2，任桂芳1，李兵順1*

（1.河北省石家莊市第五醫(yī)院感染二科，河北石家莊050021；2.河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，河北石家莊050017）

目的探討慢性乙型肝炎T細(xì)胞亞群與HBV DNA的關(guān)系。方法用流式細(xì)胞儀直接免疫熒光法測算318例慢性乙型肝炎及22例正常對照者的外周血T細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）百分率，用熒光定量PCR法檢測慢性乙型肝炎HBV DNA，比較不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎外周血T細(xì)胞亞群的變化。結(jié)果慢性乙型肝炎外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比正常對照組降低（P＜0.05）。HBV DNA高載量的慢性乙型肝炎者CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+較低載量者減少（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞百分率增加（P＜0.05）。結(jié)論HBV DNA復(fù)制增加可加重慢性乙型肝炎T細(xì)胞亞群的紊亂，CD4+/CD8+的動態(tài)變化可提示HBV感染者細(xì)胞免疫功能的變化。

肝炎，乙型，慢性；病毒；T淋巴細(xì)胞

人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）后，可出現(xiàn)不同的臨床轉(zhuǎn)歸［1-2］。慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展與機體細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)。慢性乙型肝炎患者HBV DNA載量、肝功能損害程度和體液免疫反應(yīng)等方面?zhèn)€體差異很大，細(xì)胞免疫多數(shù)表現(xiàn)為弱T細(xì)胞反應(yīng)。機體免疫反應(yīng)不足和細(xì)胞免疫功能低下導(dǎo)致不能有效清除HBV［3］，從而出現(xiàn)HBV感染慢性化。我們通過檢測HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+、CD4+、CD8+）及血清HBV DNA載量水平，探討HBV感染后細(xì)胞免疫功能的變化及其與血清HBV DNA水平的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：我院2009—2011年就診者的慢性乙型肝炎318例，男性187例，女性131例，年齡18～73歲，平均46.5歲。臨床診斷均符合2000年9月中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)分會、肝病學(xué)分會《病毒性肝炎防治方案》［4］中的慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，且在3個月內(nèi)未經(jīng)免疫調(diào)節(jié)劑及抗病毒治療。正常對照組（非乙型肝炎且無影響T細(xì)胞亞群疾患者，如高血壓病、冠心病、糖尿病等）22例，其中男性15例，女性7例，年齡18～60歲，平均49.7歲。2組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。具有可比性。

1.2 儀器和試劑：應(yīng)用美國BECKMAN COULTER公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞儀，單抗CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PC5由美國BECKMAN COULTER公司提供。HBV DNA檢測應(yīng)用美國ABI5700熒光定量PCR檢測儀，試劑由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供。

1.3 標(biāo)本收集：抽取靜脈血6mL分為2管，一管4mL用乙二胺四乙酸二鉀抗凝，用于流式細(xì)胞術(shù)檢測，另一管2mL分離血清后用于HBV DNA病毒檢測。

1.4 HBV DNA定量分析：采用熒光定量PCR法，嚴(yán)格按照試劑說明書步驟，對患者行HBV DNA檢測（HBV DNA＜0.5U/L為陰性，HBV DNA＞0.5U/L為陽性）。根據(jù)HBV DNA載量不同，將CHB患者分為HBV DNA低載量（HBV DNA1～10U/L、平均4.5U/L）與DNA高載量（HBV DNA 10～105U/L、平均5.7×103U/L）2個水平。

1.5 T淋巴細(xì)胞亞群檢測：取100 μL抗凝血加入12mm×75mm試管中，加20 μL單抗，室溫避光孵育10min，加溶血素500μL，孵育15min，加稀釋液500μL，10min后上機檢測。比較CHB組HBV DNA陽性、陰性患者與正常對照組CD+、CD+、CD+、CD4+/CD8+的不同；比較不同HBV DNA載量的CHB患者CD+、CD+、CD+、CD+/CD+。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析及q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2組外周血T細(xì)胞亞群比較：慢性乙型肝炎組患者外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞均低于正常對照組（P＜0.05）。慢性乙型肝炎組中，HBV DNA陽性患者CD+、CD+、CD+、

348CD4+/CD8+均較陰性患者升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 2組外周血T細(xì)胞亞群水平比較（±s）

表1 2組外周血T細(xì)胞亞群水平比較（±s）

*P＜0.05與正常對照組比較（q檢驗）

組別例數(shù)CD3+（%）CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+正常對照組2273.78±5.4043.60±4.3429.29±5.492.01±0.27慢性乙型肝炎組31866.30±6.20*32.54±6.53*26.60±4.36*1.36±0.75*HBV DNA陰性5565.10±19.30*31.82±10.96*25.50±9.08*1.23±0.83*HBV DNA陽性26369.70±13.40*34.80±12.30*28.20±10.50*1.33±0.72*

2.2 不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎陽性患者外周血T細(xì)胞亞群比較：與低HBV DNA載量患者相比，高HBV DNA載量慢性乙型肝炎患者CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值減少（P＜0.05），CD8+T細(xì)胞升高（P＜0.05），而CD3+T細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎陽性患者外周血T細(xì)胞亞群水平比較（±s）

表2 不同HBV DNA載量慢性乙型肝炎陽性患者外周血T細(xì)胞亞群水平比較（±s）

*P＜0.05與低HBV DNA載量比較（q檢驗）

組別例數(shù)CD3+（%）CD4+（%）CD8+（%）CD4+/CD8+低HBV DNA載量9069.15±14.0036.40±13.2028.40±9.731.31±0.77高HBV DNA載量17369.71±9.0735.52±8.95*29.37±5.98*1.28±0.46*

3 討 論

人體感染HBV后，體內(nèi)抗病毒的免疫反應(yīng)主要是細(xì)胞免疫，而T細(xì)胞在特異性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，當(dāng)T細(xì)胞通過有效溶細(xì)胞或非溶細(xì)胞機制清除病毒，感染便得到控制，反之，病毒則長期存在［5］。

本研究結(jié)果表明，慢性乙型肝炎外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群及CD4+/CD8+比值均低于正常對照組。表明慢性乙型肝炎體內(nèi)細(xì)胞免疫功能低下，可能也是T淋巴細(xì)胞凋亡增加導(dǎo)致CD3+T細(xì)胞數(shù)量下降，提示機體參加細(xì)胞免疫反應(yīng)的免疫活性細(xì)胞不足。CD4+T細(xì)胞生成減少，使特異性抗體產(chǎn)生不足，不能清除游離的HBV，可造成病毒在體內(nèi)持續(xù)存在并影響CD8+T細(xì)胞活性［6］。CD8+T數(shù)量下降，提示主要是由于輔助性T細(xì)胞減少，無法誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答以清除病毒。

流行病學(xué)調(diào)查［7］表明，持續(xù)高HBV DNA載量的慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞癌發(fā)生率增加。提示高HBV DNA水平的患者機體抗病毒及抗腫瘤能力差。在慢性乙型肝炎導(dǎo)致感染者細(xì)胞免疫功能改變的同時，HBV DNA的復(fù)制活躍進一步加重HBV感染者T細(xì)胞亞群紊亂［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，高HBV DNA載量的慢性乙型肝炎患者CD8+T細(xì)胞高于低HBV DNA載量者，提示由于慢性乙型肝炎患者存在不同程度的細(xì)胞免疫功能異常，隨著HBV復(fù)制增加，高HBV DNA載量會誘發(fā)機體免疫耐受，導(dǎo)致免疫應(yīng)答低下，尤其是影響CD+和CD+T細(xì)胞功能。CD+484T細(xì)胞對病毒特異性CD8+T細(xì)胞的活化是必不可少的。而CD8+T淋巴細(xì)胞在控制HBV感染中具有核心作用，在病毒感染過程中，CD8+T細(xì)胞最先產(chǎn)生反應(yīng)，其主要是對病毒抗原肽與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子形成的復(fù)合物產(chǎn)生應(yīng)答。本研究表明，隨著HBV復(fù)制的增加，高HBV DNA載量者的外周血CD+T細(xì)胞以及CD+/CD+減少，而CD+4488T細(xì)胞卻增加，說明出現(xiàn)了免疫功能紊亂，免疫應(yīng)答低下使機體難以清除病毒。而高HBV DNA載量者與低HBV DNA載量者的CD3+T細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與人在抗HBV過程中主要是由CD4+和CD8+T細(xì)胞直接參與有關(guān)。

綜上所述，通過對慢性乙型肝炎外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測，可以了解其免疫功能狀態(tài)，為臨床觀察提供參考。

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（本文編輯：劉斯靜）

R516.6

B

1007-3205（2012）12-1430-03

2012-05-12；

2012-08-03

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目（20090607）

王慰（1976-），女，河北石家莊人，河北省石家莊市第五醫(yī)院副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事感染性疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：crb49lbs@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.024