HPLC法同時(shí)測定口炎清顆粒中綠原酸和肉桂酸的含量

張子建，孫冬曉，董立華，王春英*

（1.河北省中醫(yī)院口腔科，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北石家莊 050017）

HPLC法同時(shí)測定口炎清顆粒中綠原酸和肉桂酸的含量

張子建1，孫冬曉2，董立華2，王春英2*

（1.河北省中醫(yī)院口腔科，河北石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析教研室，河北石家莊 050017）

目的建立同時(shí)測定口炎清顆粒中綠原酸和肉桂酸含量的方法。方法采用高效液相色譜法（high pressure liquid chromatography，HPLC），迪馬DiamonsilTMC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），乙腈-0.1%甲酸為流動相梯度洗脫，檢測波長為300nm，流速1.0mL/min，柱溫為30℃。結(jié)果肉桂酸質(zhì)量濃度在2.0～18.0mg/L范圍內(nèi)與峰面積良好的線性關(guān)系（r=0.999 9，n=5），平均加樣回收率為99.72%，相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）為1.0%；綠原酸質(zhì)量濃度在4.3～38.7mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.998 2，n= 5），平均加樣回收率為102.2%，RSD為0.7%。結(jié)論該方法準(zhǔn)確，快速，簡便，重現(xiàn)性好，回收率高，適用于口炎清顆粒的質(zhì)量控制。

口炎清顆粒；綠原酸；色譜法，高壓液相

口炎清顆粒是由天冬、麥冬、玄參、山銀花和甘草等5味中藥根據(jù)中醫(yī)理論用現(xiàn)代科技方法精制而成的中藥復(fù)方制劑（國家中藥保護(hù)品種）。其療效確切［1］，作用顯著，具有清熱養(yǎng)陰、解毒消腫的功效，用于治療陰虛火旺所致的口腔潰瘍［2］。現(xiàn)行質(zhì)量控制方法為采用高效液相色譜法測定綠原酸含量［2］。本實(shí)驗(yàn)旨在采用高效液相色譜法（high pressure liquid chromatography，HPLC）法同時(shí)測定口炎清顆粒中綠原酸和肉桂酸含量的方法，以便于提供更為全面的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與材料

Agilent Technologies 1200 series高效液相色譜儀，DAD檢測器；綠原酸和肉桂酸對照品（中國藥品生物制品鑒定所，批號分別為0737-9709和0844 -200003，供含量測定用）。乙腈為色譜純（迪馬公司），水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純?？谘浊孱w粒為市售（批號10090331，10012302，11052026）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：迪馬DiamonsilTMC18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；乙腈-0.1%甲酸為流動相，梯度洗脫（0～5min，20%乙腈；5～15min，20%～30%乙腈；15～25min，30%～70%乙腈；25～26min，70%～100%乙腈）；流速為1.0mL/min；檢測波長為300nm；柱溫為30℃，進(jìn)樣量10μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備：精密稱取綠原酸和肉桂酸對照品適量，加甲醇制成濃度分別為1.00g/L和1.07g/L的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備：精密稱定本品1.0g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10mL稱定質(zhì)量，超聲處理1h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（12 000r/min）20min，取上清液即得。

2.3 專屬性實(shí)驗(yàn)：按處方量分別制備不含山銀花和玄參藥材的陰性樣品，按“供試品溶液的制備”方法制成山銀花陰性對照溶液和玄參陰性對照溶液，依法測定。結(jié)果表明，在綠原酸和肉桂酸相應(yīng)的保留時(shí)間范圍內(nèi)無干擾色譜峰出現(xiàn)（圖1）。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取綠原酸和肉桂酸對照品溶液適量，加甲醇制成含綠原酸和肉桂酸濃度分別為2.0mg/L和4.3mg/L、6.0mg/L和12.9mg/L、10.0mg/L和21.5mg/L、14.0mg/L和30.1mg/L、18.0mg/L和38.7mg/L的混合對照品溶液，搖勻。進(jìn)樣，分別記錄綠原酸和肉桂酸的峰面積，以峰面積對樣品濃度進(jìn)行線性回歸。綠原酸的回歸方程為，Y=879.25X+5.135，r=0.998 2。表明綠原酸在2.0～18.0mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系；肉桂酸的回歸方程為，Y=1069.5X -1.265，r=0.999 9。表明肉桂酸在4.3～38.7mg/ L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)：精密稱定含綠原酸、肉桂酸濃度分別為1.37mg/g和1.70mg/g的樣品（批號10090331）0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心（12 000r/min）20min，取上清液即得。精密加入濃度為1.00g/L的綠原酸對照品溶液0.6mL和濃度為1.07g/L的肉桂酸對照品溶液0.8mL，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，離心（12 000r/min）20min，取上清液依法測定，平行測定6次，計(jì)算加樣回收率。肉桂酸的平均加樣回收率為99.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）為1.6%，綠原酸的平均加樣回收率為100.5%，RSD為1.9%。

圖1 HPLC色譜圖A.綠原酸和肉桂酸混合溶液；B.樣品溶液；C.樣品溶液加綠原酸和肉桂酸；D.山銀花陰性對照溶液；E.玄參陰性對照溶液1-綠原酸（chlorogenic acid）2-肉桂酸（cinnamic acid）Figure 1 The HPLC chromatograms of each samp leA.Standard mixed solution of chlorogenic acid and cinnamic acid；B. Sample solution；C.Sample solution spiked with chlorogenic acid and cinnamic acid；D.Negative control solution of lonicera confusa DC；E. Negative control solution of raidix scrophulariae

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)：取同一樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得肉桂酸和綠原酸峰面積的RSD分別為1.0%和0.7%。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取同一批（批號10090331）樣品，按“2.2.2項(xiàng)供試品溶液的制備”方法，平行制備6份溶液，依法測定峰面積，肉桂酸和綠原酸濃度的RSD分別為1.2%和0.8%。

2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：按“2.2.2項(xiàng)供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，分別放置0、1、2、4、6、8h后，依法測定。計(jì)算得綠原酸和肉桂酸濃度的RSD分別為1.6%和0.9%，結(jié)果表明，肉桂酸和綠原酸在樣品溶液中放置8h穩(wěn)定。

2.9 樣品測定：取口炎清顆粒樣品3批（批號10090331、10012302、11052026），分別按“2.2.2項(xiàng)供試品溶液的制備”方法制備供試品溶液，按上述方法進(jìn)行測定。分別計(jì)算樣品中肉桂酸和綠原酸的含量。結(jié)果見表1。

表1 口炎清顆粒中綠原酸和肉桂酸的含量Table 1 Contents of chlorogenic acid and cinnam ic acid in Kouyanqingkeli

3 討 論

測定波長選擇時(shí)發(fā)現(xiàn)，綠原酸和肉桂酸的λmax分別在327nm和285nm處，但是樣品在327nm和285nm下的色譜圖中二者對應(yīng)的保留時(shí)間處均有干擾峰存在。實(shí)驗(yàn)表明，在300nm處2種組分均有良好吸收，且相應(yīng)保留時(shí)間處無雜質(zhì)峰出現(xiàn)，故選擇在300nm處同時(shí)測定綠原酸和肉桂酸的含量。樣品前處理采用甲醇超聲提取，離心后測定的方法處理過程簡單，方便快速，減少有效物質(zhì)的損失。結(jié)果表明，該方法靈敏度高，重現(xiàn)性好，能準(zhǔn)確測定口炎清顆粒中綠原酸和肉桂酸的含量，可用于評價(jià)該制劑的質(zhì)量。

［1］ 曾憲濤.他克莫司軟膏加口炎清顆粒治療糜爛型OLP的療效評價(jià)［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（7）：432-433.

［2］ 中華人民共和國藥典委員會.中國藥典：一部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：465-466.

（本文編輯：劉斯靜）

DETERM INATION OF CHLOROGENIC ACID AND CINNAM IC ACID IN KOUYANQINGKELIBY HPLC

ZHANG Zijian1，SUN Dongxiao2，DONG Lihua2，WANG Chunying2*
（1.Department of Stomatology，Hebei Provincial TCM Hospital，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Pharmaceutical Analysis，the School of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China）

ObjectiveTo establish the method for simultaneous determining chlorogenic acid and cinnamic acid in Kouyanqingkeli.MethodsThe experiments were performed using HPLC with C18 column（250mm×4.6mm，5μm）as an analytical column.The mobile phase was acetonitrile 0.1% formic acid with gradient elution.The detection wavelength was chosen at 300 nm.The flow rate was 1.0mL/min.The column compartmentwas kept at the temperature of 30℃.ResultsThe linear rang of cinnamic acid was 2.0～18.0mg/L（r=0.999 9，n=5），and the mean recovery was 99.72%with relative standard deviation（RSD）of 1.0%.The linear rang of chlorogenic acid was 4.3～38.7mg/L（r=0.998 2，n=5），and themean recovery was102.2%with RSD of0.7%.ConclusionThemethod was proved to be very accurate，rapid，simple and stable for the quality control of Kouyanqingkeli.

Kouyanqingkeli；chlorogenic acid；chromatography，high pressure liquid

R917

A

1007-3205（2012）02-0172-03

2011-11-14；

2012-01-15

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（072761954）

張子建（1972-），男，河北高陽人，河北省中醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事口腔疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：wangcy730301@163.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.020