基質(zhì)金屬蛋白酶-9在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

王 毅，劉志紅，焦保華，陳永漢，張 剛

（1.河北省滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外二科，河北滄州 061000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，

河北石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊 050000）

基質(zhì)金屬蛋白酶-9在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義

王 毅1，劉志紅2，焦保華3，陳永漢1，張 剛1

（1.河北省滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外二科，河北滄州 061000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，

河北石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊 050000）

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinases，MMP-9）與腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法以52例人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)MMP-9的表達(dá)，并應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)MMP-9 mRNA在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)情況。結(jié)果MMP-9、MMP-9 mRNA的表達(dá)水平與腫瘤的分級(jí)呈正相關(guān)（r=0.925，P均＜0.01）。結(jié)論MMP-9在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，MMP-9可能與判斷預(yù)后有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；免疫組織化學(xué)

惡性腦膠質(zhì)瘤的主要特征是向周?chē)＝M織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。這一特征使得惡性腦膠質(zhì)瘤的手術(shù)全切和局部治療困難，同時(shí)也是腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和（或）再發(fā)的主要原因之一。因此，了解腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移機(jī)制十分必要。研究發(fā)現(xiàn)，這一過(guò)程涉及腫瘤細(xì)胞黏附、基質(zhì)降解、細(xì)胞遷移等許多環(huán)節(jié)。細(xì)胞外基質(zhì)在腫瘤的浸潤(rùn)和侵襲過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。而細(xì)胞外基質(zhì)的降解主要是依靠蛋白水解酶。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是蛋白水解酶中較為重要的一類(lèi)，它們通過(guò)對(duì)ECM的降解促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向周?chē)M織侵襲。本研究采用免疫組織化學(xué)和原位雜交技術(shù)，檢測(cè)MMP-9和MMP-9 mRNA在52例人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，以探討其活性與腦膠質(zhì)瘤侵襲性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：我院神經(jīng)外科2008年3月—2010年5月手術(shù)切除且保存完好的膠質(zhì)瘤組織石蠟包埋標(biāo)本52例，臨床資料完整，男性28例，女性24例，年齡7～78歲，平均42.7歲。腦膠質(zhì)瘤組織學(xué)分型根據(jù)2000年修改的WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行分類(lèi)分級(jí)，其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)（星形細(xì)胞瘤）25例，Ⅲ級(jí)（間變性星形細(xì)胞瘤）17例，Ⅳ級(jí)（多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）10例，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療與化療。

1.2 組織標(biāo)本的制備：取手術(shù)中切除的新鮮腦膠質(zhì)瘤樣本，去除血凝塊、壞死及電灼組織，用生理鹽水沖洗后迅速置于4%多聚甲醛中固定，2h后常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)切片5～6張，厚度4μm，用涂有APES載玻片貼片，60℃烘烤72h，行免疫組織化學(xué)染色和原位雜交。

1.3 試劑與方法：MMP-9單克隆抗體由武漢博士德公司提供，PV6001二抗試劑盒及濃縮型DAB試劑盒由北京中山生物技術(shù)有限公司提供，原位雜交試劑盒由武漢博士德公司提供。采用免疫組織化學(xué)PV法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9在腦膜瘤中的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用原位雜交方法檢測(cè)MMP-9 mRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 陽(yáng)性結(jié)果判定：MMP-9免疫組織化學(xué)染色位于細(xì)胞胞漿，極少數(shù)有胞核著色，光鏡下呈棕黃色或棕褐色，在400倍光鏡下至少觀察5個(gè)視野，腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞≥5%為陽(yáng)性表達(dá)，＜5%為陰性表達(dá)。MMP-9 mRNA原位雜交細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色為陽(yáng)性。以高倍視野（×400）下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量綜合判斷，采用半定量分析法。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)以上高倍視野，鏡下視野清晰，無(wú)壞死、出血，計(jì)算1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞的陽(yáng)性率。每張切片計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞，求出蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，用標(biāo)記指數(shù)（labeling index，LI）表示，LI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)×100%；mRNA表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也用LI表示。

圖1 MMP-9在Ⅰ～Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)pv法×400）Figure 1 Expression ofMMP-9 in gradeⅠ～Ⅱglioma（IHC×400）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析并作兩兩比較的q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MMP-9在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)結(jié)果：MMP-9免疫組織化學(xué)陽(yáng)性染色在胞核和胞漿中均有表達(dá)，但以胞漿著色為主，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿呈棕黃色或棕褐色（圖1～3）。低級(jí)別組（Ⅰ～Ⅱ級(jí)）膠質(zhì)瘤中MMP-9的LI是0.114 3±0.020 7；Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中MMP-9的LI分別是0.230 5±0.124 7、0.358 2±0.115 3。MMP-9的表達(dá)在膠質(zhì)瘤各級(jí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MMP-9蛋白與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)呈顯示正相關(guān)（r=0.925，P＜0.01），隨膠質(zhì)瘤級(jí)別增高，MMP-9蛋白陽(yáng)性表達(dá)升高。

圖2 MMP-9在Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)pv法×400）Figure 2 Expression ofMMP-9 in gradeⅢglioma（IHC×400）

圖3 MMP-9在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)pv法×400）Figure 3 Expression of MMP-9 in gradeⅣglioma（IHC×400）

2.2 腦膠質(zhì)瘤中MMP-9 mRNA表達(dá)情況：MMP -9 mRNA原位雜交呈棕黃色顆?；蜃睾稚w粒，著色于胞漿中及少量胞核中，呈棕黃色（圖4～6）。MMP-9 mRNA表達(dá)與MMP-9表達(dá)檢測(cè)結(jié)果基本一致。腫瘤組織中可見(jiàn)MMP-9 mRNA陽(yáng)性染色。低級(jí)別組（Ⅰ～Ⅱ級(jí)）膠質(zhì)瘤中MMP-9 mRNA的RI是0.1035±0.0207；Ⅲ、Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中MMP-9 mRNA的LI分別是0.2012±0.1084、0.4017± 0.1153。MMP-9 mRNA在膠質(zhì)瘤各組陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常腦組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；膠質(zhì)瘤各級(jí)間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MMP-9 mRNA與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)存在顯著正相關(guān)性（r=0.938，P＜0.01），隨膠質(zhì)瘤級(jí)別增高，MMP-9 mRNA陽(yáng)性表達(dá)升高。

圖4 MMP-9 mRNA在Ⅰ-Ⅱ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（原位雜交法×400）Figure4 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅠ～Ⅱglioma（in situ hybridization×400）

圖5 MMP-9 mRNA在Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（原位雜交法×400）Figure5 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅢglioma（in situ hybridization×400）

圖6 MMP-9 mRNA在Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)（原位雜交法×400）Figure6 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅣglioma（in situ hybridization×400）

3 討 論

人腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為和腫瘤細(xì)胞的侵襲情況密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移包括3個(gè)步驟，腫瘤細(xì)胞黏附到細(xì)胞外基質(zhì)，并與在基底膜表面分布的整合素受體及非整合素受體相結(jié)合；腫瘤細(xì)胞所分泌的蛋白水解酶降解、破壞由細(xì)胞間基質(zhì)和基底膜組成的細(xì)胞外基質(zhì)；伸出偽足的腫瘤細(xì)胞向已被蛋白水解酶降解的基質(zhì)區(qū)域運(yùn)動(dòng)。MMPs一方面通過(guò)降解破壞基底膜和包繞腫瘤的基質(zhì)，突破基質(zhì)屏障，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移；另一方面通過(guò)促進(jìn)新生血管的形成從而參與腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。

MMPs系統(tǒng)一類(lèi)Zn2+依賴多基因內(nèi)肽酶家族。MMPs主要由氨基端的信號(hào)肽和前肽部分，中間的催化活性區(qū)域和羧基末端區(qū)域構(gòu)成。目前普遍認(rèn)為，MMPs涉及與惡性腫瘤相關(guān)的多個(gè)過(guò)程，包括腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及腫瘤細(xì)胞的增殖。膠質(zhì)瘤的侵襲性與其MMPs的表達(dá)與活化有密切的關(guān)系。在檢測(cè)瘤組織中MMPs水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的MMP -9與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的病理分級(jí)、惡性進(jìn)展、患者預(yù)后等因素直接相關(guān)［1］。應(yīng)用Northern blotting和免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)臨床組織標(biāo)本檢測(cè)表明，膠質(zhì)細(xì)胞瘤中存在MMP-9的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并隨膠質(zhì)瘤惡性程度的增高，其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平亦明顯增加。膠質(zhì)細(xì)胞瘤中同樣觀察到細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子對(duì)MMPs基因的表達(dá)和蛋白分泌的調(diào)節(jié)作用。這些因子有白細(xì)胞介素-21、腫瘤壞死因子-α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白細(xì)胞介素-1，腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)和分泌，TGFβ則以劑量依賴方式抑制白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)的MMP -9轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。MMP-9作用于基膜，使細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解，從而血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽形成新生血管，加速腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲［2］，MMP-9是血管發(fā)生啟動(dòng)系統(tǒng)中的成員，能夠上調(diào)腫瘤血管化［3］，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。血管形成是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)［4］，高級(jí)別膠質(zhì)瘤微血管密度（microvessel density，MVD）表達(dá)顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤（P＜0.01），MVD的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)呈正相關(guān)，MMP-9與腫瘤MVD表達(dá)強(qiáng)度情況相關(guān)，隨著MMP-9表達(dá)增高，MVD也逐漸增加，其血管形成趨向活躍，提示了在膠質(zhì)瘤血管形成中MMP-9可能具有正向調(diào)節(jié)作用。血管形成是膠質(zhì)瘤侵襲和生長(zhǎng)的必要條件之一，新形成的血管造成的裂隙為腫瘤細(xì)胞向外侵入周?chē)＝M織開(kāi)啟了道路，MMP-9既可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，使之從腫瘤鄰近組織遷徙到腫瘤組織，又可以與一些血管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子協(xié)同作用最終參與腫瘤組織新生血管形成。Rooprai等［5］發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的瘤細(xì)胞和腫瘤的血管基底膜及內(nèi)皮細(xì)胞均有MMP-9的表達(dá)，其表達(dá)隨著膠質(zhì)瘤病理級(jí)別的增高而增強(qiáng)。

本結(jié)果與上述報(bào)道結(jié)果相似，說(shuō)明在腦膠質(zhì)瘤中MMP-9表達(dá)增高，且與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。MMP-9與腫瘤的侵襲性有密切關(guān)系，可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。提示MMP-9可以作為判斷腫瘤預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

［1］ 張軍普，許雯，劉向輝.PTEN、E-cd和MMP-9在人腦膠質(zhì)瘤的表達(dá)和意義［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，48（2）：109-112.

［2］ 李樹(shù)合，周定標(biāo)，余新光，等.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中MMPs和TMPs的表達(dá)及其與瘤周水腫的相關(guān)性分析［J］.軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27（3）：214-215.

［3］ SEANDEL M，NOACK-KUNNMANN K，ZHU D，et a1.Growth factor-induced a-ngiogenesis in vivo requires specifc cleavageof fibrillar type I collagen［J］.Blood，2001，97（8）：2323-2332.

［4］ 孫榮輝，徐國(guó)政.VEGF、MMP-9在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義［J］.中國(guó)臨床神經(jīng)外科雜志，2010，15（5）：273-277.

［5］ ROOPRAIHK，RNCKLIDGE GJ，PANOU C，et al.The effects of exogenous growth factors on matrix metalloproteinase secretion by human brain tumor cell［J］.Br JCancer，2000，82（1）：52-55.

（本文編輯：劉斯靜）

EXPRESSION OF MMP-9 IN HUMAN GLIOMA AND THEIR SIGNIFICANCE IN THE PATHOGENESIS

WANG Yi1，LIU Zhihong2，JIAO Baohua3，CHEN Yonghan1，ZHANG Gang1
（1.Department of Neurosurgery，Cangzhou Central Hospital，Hebei Province，Cangzhou 061000，China；2.Department of
Endocrinology，the Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China；3.Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the relationship between the matrix metalloproteinases-9（MMP-9）and the pathogenesis of brain glioma.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of MMP-9 in 52 cases of brain glioma，MMP-9 mRNA was detected in brain glioma by in situ hybridization.ResultsThe expression of MMP-9 was positively correlated with tumor classification（P＜0.01）.There was positive correlation between MMP-9 mRNA and tumor classification（P＜0.01）.ConclusionMMP-9 may be involved in the development of brain glioma. MMP-9 is a prognostic indicator in brain glioma.

matrixmetalloproteinases；glioma；immunohistochemistry

R739.4

A

1007-3205（2012）02-0147-04

2011-09-30；

2011-12-23

王毅（1980-），男，山東冠縣人，河北省滄州市中心醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事神經(jīng)外科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.009