枯草芽孢桿菌工程菌產(chǎn)耐酸性高溫α-淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

胡 博，劉逸寒，徐艷靜，薄嘉鑫，路福平

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

α-淀粉酶作為淀粉酶的一種，是目前最重要、最古老、應(yīng)用范圍最廣的工業(yè)酶制劑之一，其中耐高溫α-淀粉酶憑借其熱穩(wěn)定上的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)占據(jù)了很大的市場(chǎng)[1]．耐高溫α-淀粉酶目前被廣泛地應(yīng)用于味精、啤酒、有機(jī)酸、酒精等食品發(fā)酵以及淀粉工業(yè)[2-3]．目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中常用的耐高溫α–淀粉酶的最適 pH范圍為 6～7[4]，在酸性條件下酶活明顯降低，甚至失去活性，已經(jīng)不能滿足酸性條件下淀粉原料深加工工藝的要求，因此對(duì)耐酸性α-淀粉酶的需求日益上升．近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)開(kāi)展了大量的針對(duì)產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶菌株發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，王淑軍等[5]對(duì) 1株產(chǎn)耐熱酸性α-淀粉酶的超嗜熱古菌進(jìn)行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化后α-淀粉酶活力達(dá)到了 500,U/mg；劉雅琴等[6]在篩選出的耐酸性α-淀粉酶產(chǎn)生菌的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終α-淀粉酶活力達(dá)到 31.4,U/mL，比初始時(shí)提高了 0.65倍；莫新迎等[7]通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì) 1株產(chǎn)耐酸性α-淀粉酶的小孢根霉菌培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，α-淀粉酶活力較優(yōu)化前提高了 0.15倍，達(dá)到259.902,U/g干物質(zhì)，但其酶活力均不高．

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)本課題組前期研究獲得的可高效表達(dá)耐酸性高溫α-淀粉酶枯草芽孢桿菌工程菌株pWB-amyd/WB600[8-10]發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高耐酸性高溫α-淀粉酶活力，為以淀粉為原料的深加工工業(yè)的發(fā)展提供有力支撐．

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)耐酸性高溫α-淀粉酶工程菌株 pWB-amyd/WB600，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[9]并保藏．以初始發(fā)酵培養(yǎng)基及未優(yōu)化的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，初始酶活力為1,890,U/mL．

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，瓊脂粉 20，卡那霉素 0.03，pH 自然．

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，卡那霉素 0.03，pH 自然．

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨 10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，pH 自然．

1.3 培養(yǎng)方法

種子的培養(yǎng)：取凍存于–70,℃的工程菌株 pWB-amyd/WB600，將其接種到新鮮斜面培養(yǎng)基，37,℃培養(yǎng) 18,h后，挑取單菌落接入種子培養(yǎng)基，37,℃、200,r/min搖床培養(yǎng)16,h，得到種子液．

初始發(fā)酵培養(yǎng)：以 1%接種量接種至裝液量50,mL發(fā)酵培養(yǎng)基的 250,mL三角瓶中，在 37,℃、160,r/min培養(yǎng)36,h．

1.4 生長(zhǎng)曲線的繪制

配制 400,mL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝至 250,mL三角瓶，編號(hào)為 1—8，每瓶裝液量 50,mL，121,℃滅菌20,min，待用．從新鮮斜面培養(yǎng)基挑取單菌落接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于 37,℃、200,r/min搖床振蕩培養(yǎng)．每隔一定時(shí)間取樣．將菌液適當(dāng)稀釋至吸光度在0.1～1.0范圍內(nèi)，用分光光度計(jì)于光程1,cm、波長(zhǎng) 600,nm條件下測(cè)定其吸光度．以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制重組菌生長(zhǎng)曲線．

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.5.1 碳源的選擇

選擇 10,g/L的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精、玉米粉、薯干粉作為碳源，氮源為10,g/L的蛋白胨，比較不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響，確定最適碳源．再以10,g/L的蛋白胨為氮源，加入10、20、30、40、50,g/L的最適碳源，確定最適碳源的最優(yōu)質(zhì)量濃度．

1.5.2 氮源的選擇

以最適質(zhì)量濃度的最適碳源為培養(yǎng)基基本組分，分別加入 10,g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、NH4NO3、NH4Cl，比較不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響，確定最適氮源．再以最適質(zhì)量濃度的最適碳源為培養(yǎng)基基本組分，加入 10、20、30、40、50,g/L 的最適氮源，確定最適氮源的最優(yōu)質(zhì)量濃度．

1.5.3 金屬離子Ca2+對(duì)產(chǎn)酶的影響

以最優(yōu)質(zhì)量濃度的最適碳源、氮源為培養(yǎng)基基本組分，加入 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0,g/L 的 Ca2+進(jìn)行發(fā)酵，確定Ca2+的最優(yōu)質(zhì)量濃度．

1.5.4 Na2HPO4對(duì)產(chǎn)酶的影響

以最優(yōu)濃度的最適碳源、氮源、Ca2+為培養(yǎng)基基本組分，加入 0、4、8、12、16,g/L 的 Na2HPO4進(jìn)行發(fā)酵，確定Na2HPO4的最優(yōu)質(zhì)量濃度．

1.5.5 正交實(shí)驗(yàn)

利用 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)篩選出玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4的最佳配比．

1.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.6.1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

以上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，用一定濃度的 NaOH或 HCl溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始 pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 進(jìn)行發(fā)酵，確定培養(yǎng)基最適初始pH．

1.6.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

以原始發(fā)酵培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，分別按 1%、2%、3%、4%和 5%的接種量接種到優(yōu)化后的最優(yōu)培養(yǎng)基中，在 37,℃、160,r/min培養(yǎng) 36,h，取樣測(cè)定酶活力，確定最適接種量．

1.6.3 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

按優(yōu)化后所得的最適接種量將種子液分別接種于裝有 20、30、40、50、60、70,mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，在 37,℃、160,r/min培養(yǎng) 36,h，取樣測(cè)定酶活力，確定最適裝液量．

1.6.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量和裝液量均按照優(yōu)化后的結(jié)果，在 37,℃條件下，搖床轉(zhuǎn)速分別為 120、160、200、240,r/min 培養(yǎng) 36,h，取樣測(cè)定酶活力，確定最適搖床轉(zhuǎn)速．

1.6.5 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量、裝液量及搖床轉(zhuǎn)速均按照優(yōu)化后的結(jié)果，在27、32、37、42,℃分別培養(yǎng)36,h，取樣測(cè)定酶活力，確定最適發(fā)酵溫度．

1.7 酶活檢測(cè)

參照QB/T 2306—1997[11]．酶活力單位定義：在70,℃、pH 6.0條件下，1,min液化1,mg可溶性淀粉成為糊精所需要的酶量，即為 1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示．

式中：X，樣品的酶活力(U/mL)；c，測(cè)試的酶液濃度(U/mL)；n，樣品的稀釋倍數(shù)；16.67，換算常數(shù)．

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

工程菌株pWB-amyd/WB600生長(zhǎng)曲線如圖1所示．由圖 1可知，0～12,h為生長(zhǎng)的延滯期；12～18,h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；從18,h開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期．由于在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期，菌體量較大，此時(shí)菌體還未發(fā)生自溶，因此確定在接種后18,h時(shí)收集菌體．

圖1 工程菌株pWB-amyd/WB600生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of pWB-amyd/WB600

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響

初始發(fā)酵培養(yǎng)基中無(wú)特定的碳源，胰蛋白胨和酵母提取物僅能維持菌體生長(zhǎng)至A600為3.0左右[12]，為了考察重組菌株對(duì)碳源的利用情況，本實(shí)驗(yàn)選擇了幾種常用的碳源進(jìn)行碳源的優(yōu)化．由表 1結(jié)果可知，玉米粉是產(chǎn)酶的最佳碳源，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高值，為 2,090,U/mL，其余依次為可溶性淀粉、糊精、薯干粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖．玉米粉的最優(yōu)質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著玉米粉質(zhì)量濃度的增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力也隨之增加，當(dāng)玉米粉質(zhì)量濃度為 20,g/L時(shí)，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為 2,310,U/mL．當(dāng)繼續(xù)加大玉米粉質(zhì)量濃度時(shí)，其耐酸性高溫α-淀粉酶活力不再隨玉米粉質(zhì)量濃度的增加而增加，反而隨之下降，所以本實(shí)驗(yàn)選取20,g/L為玉米粉的最適質(zhì)量濃度．

表1 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Tab.1 Effects of carbon resource on the yield of enzyme

2.2.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

為了考察重組菌株對(duì)碳源的利用情況，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源進(jìn)行研究，選擇 10,g/L的胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米漿、尿素、NH4NO3、NH4Cl作為氮源，碳源為20,g/L的玉米粉，其他條件相同，結(jié)果見(jiàn)表2．

表2 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Tab.2 Effects of nitrogen resource on the yield of enzyme

由表 2可知，重組菌株利用以上氮源培養(yǎng)時(shí)，有機(jī)氮源對(duì)產(chǎn)酶的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源．單一的無(wú)機(jī)氮源作為培養(yǎng)基中的氮源，菌體生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶量較低．而有機(jī)氮源中，蛋白胨是最佳的氮源，其主要成分是各種氨基酸、肽類等可溶性氮化合物，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高值，為2,310,U/mL．蛋白胨最優(yōu)濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著蛋白胨濃度的增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力也隨之增加，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為 30,g/L時(shí)，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為2,620,U/mL．所以本實(shí)驗(yàn)選取30,g/L為蛋白胨最適質(zhì)量濃度．

2.2.3 金屬離子Ca2+質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

根據(jù) Machius等[13]的研究可知，Ca2+的添加對(duì)產(chǎn)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶有明顯的促進(jìn)作用，這是因?yàn)楫a(chǎn)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶是一種金屬酶，金屬離子Ca2+與之結(jié)合，有利于保持α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及其活力．故選用不同質(zhì)量濃度的 Ca2+進(jìn)行發(fā)酵，由圖2中可以看出，隨著Ca2+質(zhì)量濃度的增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力也隨之增加，當(dāng) Ca2+質(zhì)量濃度為 0.6,g/L時(shí)，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為2,740,U/ mL．當(dāng)繼續(xù)加大Ca2+質(zhì)量濃度時(shí)，其耐酸性高溫α-淀粉酶活力不再隨Ca2+質(zhì)量濃度的增加而增加，反而隨之下降，所以本實(shí)驗(yàn)選取0.6,g/L為Ca2+最適質(zhì)量濃度．

圖2 CaCl2質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of CaCl2concentration on the yield of enzyme

2.2.4 磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響

磷酸鹽對(duì)微生物產(chǎn)酶的作用是非常重要的，磷是細(xì)胞合成核酸必需的一種元素，也是加快吸收葡萄糖，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)不可或缺的一種物質(zhì)．所以耐酸性高溫α-淀粉酶活力隨著磷酸鹽質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)磷酸鹽濃度為8,g/L時(shí)，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為 2,870,U/mL．但是隨著磷酸鹽質(zhì)量濃度的繼續(xù)升高，耐酸性高溫α-淀粉酶活力卻隨之下降，所以本實(shí)驗(yàn)選取 8,g/L為磷酸鹽最適質(zhì)量濃度(圖 3)．

圖3 磷酸鹽質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of Na2HPO4 concentration on the yield of enzyme

2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)

利用 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)篩選出玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4的最佳配比，結(jié)果見(jiàn)表3．

表3 培養(yǎng)基配方正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其極差分析Tab.3 Results and variance analysis of orthogonal experiment of medium components

由表 3可知，在玉米粉、蛋白胨、CaCl2和Na2HPO4這4種培養(yǎng)基組分的不同配比中，耐酸性高溫α-淀粉酶活力最高的組合為(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨 30，CaCl20.5，Na2HPO48．極差分析結(jié)果表明4個(gè)因素的影響程度依次為：玉米粉＞蛋白胨＞Na2HPO4＞CaCl2．

由于從理論上優(yōu)化得到的培養(yǎng)基不在正交實(shí)驗(yàn)表中，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到 3,280,U/mL，此活力大于正交實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的所有結(jié)果，驗(yàn)證了選取該結(jié)果的正確性．因此，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨30，CaCl20.5，Na2HPO48．

2.3 發(fā)酵條件

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響

pH是影響微生物正常生理活動(dòng)的一個(gè)重要因素．由圖4結(jié)果顯示，發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH在5.0～8.0之間，都可產(chǎn)生耐酸性高溫α-淀粉酶，初始pH為6.5時(shí)，即發(fā)酵培養(yǎng)基自然 pH，耐酸性高溫α-淀粉酶活力最高，達(dá)到3,280,U/mL．所以本實(shí)驗(yàn)選取pH,6.5為最適初始pH．

圖4 初始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effects of pH on the yeild of enzyme

2.3.2 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響

由圖 5結(jié)果顯示，在接種量為 1%時(shí)，由于菌體數(shù)量過(guò)低，減少了蛋白質(zhì)分泌總量，因此酶活力較低．當(dāng)以 2%的接種量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，菌體蛋白分泌較高，酶活力顯著提高，耐酸性高溫α-淀粉酶活力最高，達(dá)到 3,450,U/mL．隨著接種量繼續(xù)增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力卻隨之下降．根據(jù)余曉紅等[14]的研究可知，這是由于培養(yǎng)基中菌體相對(duì)密度增大，導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)時(shí)所需培養(yǎng)基成分不足同時(shí)溶氧不足，菌體生長(zhǎng)狀態(tài)不良，反而使酶活力降低造成的，所以本實(shí)驗(yàn)選取2%為最適接種量．

圖5 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effects of inoculation volume on the yield of enzyme

2.3.3 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，能夠提供充足的氧分對(duì)于提高產(chǎn)酶量具有重要的作用，在一定范圍內(nèi)，裝液量越低，產(chǎn)酶量越高．由圖 6結(jié)果顯示，裝液量在30,mL以上時(shí)，隨著裝液量的增加，發(fā)酵過(guò)程中溶氧量不足，菌體生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致耐酸性高溫α-淀粉酶活力下降．當(dāng)裝液量為30,mL時(shí)，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為 3,670,U/mL．裝液量為 20,mL時(shí)，雖然溶解氧量充足，但是由于養(yǎng)分不足，菌體生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致耐酸性高溫α-淀粉酶活力下降．所以本實(shí)驗(yàn)選取30,mL/250,mL為最適裝液量．

圖6 裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effects of medium volume on the yield of enzyme

2.3.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速同樣影響發(fā)酵液中氧氣的溶解量．由表 4結(jié)果顯示，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速較低時(shí)，發(fā)酵液中氧氣的溶解量不足，不利于菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致耐酸性高溫α-淀粉酶活力下降，因而耐酸性高溫α-淀粉酶活力隨著轉(zhuǎn)速的升高而變高，當(dāng)達(dá)到200,r/min時(shí)，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為3,980,U/mL．隨著搖床轉(zhuǎn)速的繼續(xù)升高，耐酸性高溫α-淀粉酶活力卻隨之降低，所以本實(shí)驗(yàn)選取200,r/min為最適搖床轉(zhuǎn)速．

表4 轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響Tab.4 Effects of rotation speed on the yield of enzyme

2.3.5 溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響結(jié)果見(jiàn)表5．

表5 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Tab.5 Effects of cultivated temperature on enzyme production

由表 5結(jié)果顯示，低溫不利于菌株生長(zhǎng)產(chǎn)酶，隨著溫度升高，反應(yīng)速度加大，生長(zhǎng)代謝加快，生產(chǎn)期提前，菌株的產(chǎn)酶量大幅度提高，當(dāng)溫度到達(dá) 37,℃時(shí)，菌體的生長(zhǎng)最旺盛，菌株的產(chǎn)酶活力大幅度增加，耐酸性高溫α-淀粉酶活力達(dá)到最高，為 3,980,U/mL．但是隨著溫度的繼續(xù)升高使得菌體易于衰老，發(fā)酵周期縮短，導(dǎo)致產(chǎn)物的最終產(chǎn)量降低．所以本實(shí)驗(yàn)選取37,℃作為最適發(fā)酵溫度．

3 結(jié) 論

枯草芽孢桿菌工程菌株 pWB-amyd/WB600，具有高拷貝的重組表達(dá)質(zhì)粒，且具有良好地遺傳穩(wěn)定性，可高效表達(dá)耐酸性高溫α-淀粉酶．本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)該工程菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化．分別研究碳源、氮源、金屬離子以及磷酸鹽對(duì)耐酸性高溫α-淀粉酶活力的影響，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為(g/L)：玉米粉 20，蛋白胨 30，CaCl20.5，Na2HPO48．同時(shí)，確定了搖瓶最佳發(fā)酵工藝：將重組菌的單菌落接種于種子培養(yǎng)基(50,mL/250,mL三角瓶)中，于 37,℃、200,r/min條件下培養(yǎng)18,h后，以2%接種量接種于優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基(30,mL/250,mL 三角瓶)中，初始 pH 6.5，37,℃、200,r/min培養(yǎng) 36,h后，最終得到的耐酸性高溫α-淀粉酶活力為3,980,U/mL，是優(yōu)化前活力的2.1倍．

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