莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)兔血小板聚集后環(huán)氧酶的影響

孫盼莉，魏守蓉，王曉鋒，王，陳乃宏，薛存寬，劉浩

莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)兔血小板聚集后環(huán)氧酶的影響

孫盼莉1,2，魏守蓉1，王曉鋒2,3，王文2，陳乃宏3，薛存寬1，劉浩1

目的研究莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)兔血小板聚集后環(huán)氧酶(Cox)含量的影響。方法利用酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)不同給藥組間ADP誘導(dǎo)體外分離的兔血小板聚集后Cox的含量。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，莫諾苷各劑量組均能顯著降低ADP誘導(dǎo)兔血小板聚集后Cox的含量(P＜0.001)，并具有較好的濃度依賴性，其中高劑量組抑制率達(dá)30%左右。結(jié)論莫諾苷可能通過(guò)影響Cox的含量抑制ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集。

莫諾苷；血小板聚集；環(huán)氧酶；兔

[本文著錄格式]孫盼莉，魏守蓉，王曉鋒，等.莫諾苷對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)兔血小板聚集后環(huán)氧酶的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2012,18(4):331-332.

莫諾苷(morroniside)是本實(shí)驗(yàn)室從常用中藥山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)的有效成分環(huán)烯醚萜苷中分離得到的單體化合物，對(duì)其前期研究發(fā)現(xiàn)，莫諾苷對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系具有抗氧化應(yīng)激、抗凋亡、抗細(xì)胞鈣超載及促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子釋放等保護(hù)作用[1-5]；能減小大鼠局灶性腦缺血再灌注模型腦梗死體積[6]，增強(qiáng)皮層抗炎能力[7]。此外，莫諾苷能顯著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和血小板活化因子(platelet activation factor,PAF)誘導(dǎo)的兔血小板聚集，尤其對(duì)ADP的抑制作用選擇性強(qiáng)[8]。環(huán)氧酶是阿司匹林(acetyl salicilic acid,ASA)抗血小板聚集的作用靶點(diǎn)，本文則通過(guò)體外研究莫諾苷在ADP誘導(dǎo)血小板聚集后對(duì)環(huán)氧酶含量的影響，進(jìn)一步從分子角度探討莫諾苷抗血小板聚集的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物 莫諾苷由本室從山茱萸中提取制備，高效液相分析，純度約98.5%，臨用前用蒸餾水溶解成所需濃度。ASA為SIGMA公司產(chǎn)品，臨用時(shí)用蒸餾水溶解，以0.1mol/L NaHCO3調(diào)pH至7.0左右，再加蒸餾水稀釋到所需濃度。

1.2試劑 ADP(SIGMA公司)配制成7.5 mg/m l儲(chǔ)存液，分裝，-20℃密封保存，臨用前稀釋，終濃度為10μmol/L；環(huán)氧酶(cycloxygenase,Cox)ELISA試劑盒(R&D公司)。

1.3動(dòng)物及儀器 新西蘭大耳白兔：體重(3.0±0.5) kg，SPF級(jí)，由北京開(kāi)源兔業(yè)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，合格證號(hào)SCXK(京)2006-0005；SC-2000 M icrofuge低溫離心機(jī)(美國(guó)BECK-MAN公司)；IMT22型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(LP400型)(法國(guó)Diagnostic Pasteur)。

1.4方法

1.4.1血小板的制備[9]2.5～3 kg雄性新西蘭大耳白兔，經(jīng)兔頸總動(dòng)脈取血，枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)，取230 g離心10 m in，取上清得富含血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)；PRP 800 g離心15m in，得沉淀即血小板。

1.4.2負(fù)載血小板懸液的制備 配制無(wú)鈣Hepes buffer和1mmol/L含鈣Hepesbuffer血小板經(jīng)無(wú)鈣Hepesbuffer洗滌2次；再用1 mmol/L含鈣Hepes buffer重懸。取懸液分組即空白對(duì)照組，莫諾苷低、中、高劑量組，ASA組，每組5份，各取上述懸液300μl待用。

1.4.3加藥作用及離得樣品 莫諾苷低、中、高劑量組分別加濃度為3.0mg/m l、6.0mg/m l、12.0mg/m l的莫諾苷溶液各10μl，ASA組加0.5 mg/m l的ASA溶液10μl，空白對(duì)照組加等體積的生理鹽水，與血小板懸液作用5m in；加ADP(終濃度為10μmol/L)誘導(dǎo)血小板聚集5m in；然后各組加入0.1mol/L HCl 20μl終止炎癥反應(yīng)；最后14000 r/m in離心2m in，取得上清用于測(cè)定Cox的含量。

1.4.4 Cox含量 按Cox ELISA試劑盒(R&D)操作[10]測(cè)定Cox活性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。組間樣本均數(shù)比較用單因素方差分析(one-way analysisof variance,ANOVA)，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

Cox作為ADP誘導(dǎo)血小板聚集過(guò)程中的重要物質(zhì)，其含量可一定程度反映血小板聚集程度。與空白對(duì)照組相比，ASA組顯著抑制血小板聚集Cox酶活性的增強(qiáng)，抑制率達(dá)到40%左右，表明血小板聚集功能正常，而ASA可較強(qiáng)地抑制血小板聚集引起的Cox酶活性的增強(qiáng)。與空白對(duì)照組相比，莫諾苷低、中、高劑量組均可降低ADP誘導(dǎo)血小板聚集引起的Cox酶活性增強(qiáng)，并具有較好的濃度依賴性，其中高劑量組(12mg/m l)的抑制率達(dá)30%左右。見(jiàn)表1。

表1 莫諾苷對(duì)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集Cox含量的影響

3 討論

心腦血管疾病的發(fā)病率、死亡率及致殘率均高，近年來(lái)我國(guó)的流行病學(xué)資料表明，其在人口死因順序中城市居第1位、農(nóng)村居第2位，給社會(huì)和國(guó)家?guī)?lái)巨大的負(fù)擔(dān)。隨著研究的進(jìn)展，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到血小板在動(dòng)脈系統(tǒng)血栓形成中的關(guān)鍵作用，心腦血管疾病具有相似的病理生理機(jī)制和藥物治療手段。由于能控制凝血酶的生成及其活性，抗血小板治療已成為預(yù)防和治療動(dòng)脈系統(tǒng)血栓的基石?？寡“寰奂闹委熢诜乐卧擃惣膊≈械淖饔酶堑玫綇V泛證實(shí)。藥物的選擇也不僅僅是ASA，其他藥物如氯比格雷、西洛他唑、替羅非班等對(duì)心腦血管病的重要治療作用已得到證實(shí)并廣泛應(yīng)用于臨床。盡管常用的抗血小板聚集藥物如ASA在預(yù)防腦卒中和急性心肌梗死方面發(fā)揮著重要作用，但是長(zhǎng)期服用容易造成胃潰瘍、腎損害以及精神障礙等不良反應(yīng)，而且藥物反應(yīng)性不同也影響其在治療中的有效性。這些都激勵(lì)著人們不斷研制和尋找更好的新型抗血小板藥物，其中中醫(yī)中藥學(xué)者也逐漸認(rèn)識(shí)到血小板在血瘀癥發(fā)病學(xué)和活血化瘀中藥藥理上起著重要作用，有抗血小板聚集作用的中藥及其方劑運(yùn)用于臨床，研究活血化瘀中藥的活性成分，進(jìn)而開(kāi)發(fā)出新藥，是中藥現(xiàn)代化研究的課題。一些單體化合物及有效成分在抗血小板聚集方面的作用也得到研究證實(shí)，如川芎嗪、芍藥酚、銀杏內(nèi)酯、姜黃酮、丹酚酸及人參皂苷等均有很好的作用。

在體內(nèi)血小板聚集是極其復(fù)雜的過(guò)程，目前已知血小板的聚集反應(yīng)至少通過(guò)ADP、血栓素A2和PAF等3條途徑激活，而各種誘導(dǎo)劑如ADP、AA、PAF等均可通過(guò)上述不同途經(jīng)激活血小板聚集。在前期的研究中，已知莫諾苷可以不同程度抑制ADP、AA、PAF誘導(dǎo)的兔血小板聚集，尤其是對(duì)ADP誘導(dǎo)的兔血小板聚集有較好的選擇性。本文著重通過(guò)測(cè)定莫諾苷是否能夠抑制ADP誘導(dǎo)后Cox活性，初步探討莫諾苷抑制血小板聚集的可能機(jī)制。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)看，莫諾苷可以不同程度抑制ADP誘導(dǎo)兔血小板聚集后Cox的生成。從分子機(jī)制證明莫諾苷可能通過(guò)減少Cox的含量，抑制兔血小板聚集。但是由于體內(nèi)血小板聚集機(jī)制復(fù)雜，涉及到多種因素，因此對(duì)于莫諾苷抗血小板聚集機(jī)制探索還有待于更進(jìn)一步的研究。

[1]Wang W,Huang WT,Li L,et al.M orroniside prevents peroxideinduced apoptosis by induction of endogenous glutathione in human neuroblastoma cells[J].Cell Mol Neurobiol,2008,28: 293-305.

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Effects of M orroniside on Cycloxygenase after Platelet Aggregation Induced by Adenosine Diphosphate in Rabbits

SUN Pan-li, WEIShou-rong,WANG Xiao-feng,etal.TongjiMedical College ofHuazhong University ofScience and Technology,Wuhan 430030,Hubei, China

Ob jectiveTo investigate the effect ofmorroniside on cycloxygenase(Cox)in the condition of platelet aggregation induced by adenosine diphosphate(ADP)in rabbits.M ethodsThe levels of Cox induced by ADP in different groups were detected by enzyme-linked immunosorbentassay(ELISA).Results Compared w ith the control group,all themorroniside groups significantly inhibited the increase of Cox induced by ADP(P＜0.001),which had concentration dependence,and the inhibition rate of high dose group was 30%.Conclusion M orroniside can decrease the level of Cox and itmay be themechanism ofmorroniside on inhibiting the platelet aggregation induced by ADP in rabbits.

morroniside;plateletaggregation;cycloxygenase;rabbits

R285.5

A

1006-9771(2012)04-0331-02

2011-10-18)

1.“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2009ZX 09103-366)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173575，30740053)；3.北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(7062031)；4.北京市教委(PXM 2011_014226_07_000071)；5.2011年北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才。

1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢市430030；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京市100053；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所，北京市100050。作者簡(jiǎn)介：孫盼莉(1985-)，女，湖北武漢市人，碩士研究生，主要研究方向：缺血性腦損傷。通訊作者：魏守蓉。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.005