天麻色譜學(xué)分類與品質(zhì)評(píng)價(jià)

譚碧君，孔海文，陶 鈞

(長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114)

生化指紋圖譜技術(shù)是鑒定和評(píng)價(jià)中藥和天然藥物質(zhì)量最有效的科學(xué)方法之一。通過(guò)測(cè)定生化指紋圖譜能檢測(cè)到藥用植物中絕大多數(shù)生化成分，不僅能反映不同來(lái)源的同種藥物的共性，而且能顯示同種不同遺傳類群天然藥物的特殊性，并能根據(jù)指紋圖譜相似性對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分類，也能根據(jù)各種生化成分的峰面積確定其含量并作出科學(xué)評(píng)價(jià)，還能用于不同來(lái)源的同種藥物以及同一來(lái)源的不同種藥物的鑒定。HPLC指紋圖譜精確、高效，是測(cè)定生化指紋圖譜最常用的方法[1～3]。因此，中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局已將HPLC指紋圖譜列為中藥和天然藥物的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[SFDA，2007(743號(hào))]。研究先進(jìn)、實(shí)用的天然藥物生化指紋圖譜鑒定技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)[4～7]。

天麻是我國(guó)四大名貴中藥材(冬蟲夏草、人參、鹿茸)之一。天麻及其有效成分天麻素具有多種藥理作用[8～12]，且毒副作用小。天麻的質(zhì)量和真?zhèn)瓮ǔ{肉眼觀察和經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)天麻個(gè)體大小、成色和原產(chǎn)地來(lái)判斷，缺乏科學(xué)性。為了建立天麻質(zhì)量和真?zhèn)蔚脑u(píng)價(jià)方法，王莉等[13]、謝笑天等[14]、張煒等[15]研究了天麻的HPLC指紋圖譜識(shí)別和評(píng)價(jià)方法，但存在分離效果差、檢測(cè)到的生化成分少、圖譜不夠清晰、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、浪費(fèi)大量化學(xué)試劑等問(wèn)題，尤其未見(jiàn)利用指紋圖譜相似性對(duì)藥用植物進(jìn)行分類和評(píng)價(jià)，探討生化指紋圖譜、有效成分含量和原產(chǎn)地三者之間關(guān)系的報(bào)道。

為了建立天麻生化指紋圖譜最佳測(cè)定方法，利用指紋圖譜對(duì)天麻進(jìn)行科學(xué)分類和評(píng)價(jià)，作者運(yùn)用優(yōu)化的高效液相色譜方法測(cè)定了9種天麻的生化指紋圖譜及其天麻素含量；運(yùn)用分析軟件計(jì)算了它們的生化指紋圖譜的相似系數(shù)；運(yùn)用聚類分析方法和相似系數(shù)對(duì)天麻進(jìn)行系統(tǒng)分類；并根據(jù)天麻素含量和色譜峰面積對(duì)天麻品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

9種天麻樣本分別采自湖南石門、湖北宜昌、安徽大別山、貴州大方、陜西略陽(yáng)、西藏察愚、云南彝良、四川涼山和吉林長(zhǎng)白山。每種天麻采集12個(gè)樣本(大、中、小各4個(gè))，由湖南德海藥材開(kāi)發(fā)公司專家鑒定后，儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱中。

標(biāo)準(zhǔn)天麻(批號(hào)120944-200905)、天麻素對(duì)照品(批號(hào)110807-200905，純度99％以上)，中國(guó)藥品與生物制品檢定所。

乙腈為色譜純，其它試劑均為分析純。

Agilent 1100型高效液相色譜儀[DE43628782型液壓泵、JP40718258型樣本注射器、DE43623222型檢測(cè)器、Eclipse XDB-C8色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)],德國(guó)Waldbronn公司;JY92-2D型超聲波細(xì)胞破碎器,浙江。

1.2 天麻素對(duì)照品溶液的制備

精確稱取天麻素對(duì)照品(80 ℃干燥1 h)0.5 mg，置10 mL容量瓶中，用10％乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，置冰箱中備用。

1.3 天麻樣本處理

新鮮天麻蒸煮、烘干后，研成粉末，過(guò)80目篩，然后置80 ℃ 干燥箱中烘1 h。精確稱取1 g天麻粉末置萃取器中，加70％ 乙醇溶液混勻。先將萃取器置于97 ℃熱水中處理20 min；再用超聲波處理25 min(超聲波處理9 s，停2 s，功率250 W)。超聲波處理后用乙醇溶液補(bǔ)足損失的水分。同法重復(fù)處理1次。用濾紙過(guò)濾處理過(guò)的樣本溶液，收集濾液。蒸發(fā)，獲得干燥萃取物。用流動(dòng)相溶解萃取物，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，置冰箱中備用。

1.4 色譜條件的篩選

基本色譜條件為：柱溫25 ℃，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL。

以10％乙腈溶液和梯度濃度乙腈溶液(0～1.5 min為純水,1.6～3.5 min為5％乙腈,3.6～8 min為10％乙腈)為流動(dòng)相，以221 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，用高效液相色譜儀測(cè)定天麻樣本的生化指紋圖譜，比較兩種不同流動(dòng)相的分離效果，篩選最適流動(dòng)相。

以優(yōu)化的梯度濃度乙腈溶液為流動(dòng)相，比較5種檢測(cè)波長(zhǎng)(221 nm、219 nm、217 nm、215 nm、213 nm)檢測(cè)效果，篩選最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.5 方法的精密度、天麻素的穩(wěn)定性和回收率測(cè)定以及樣本量與天麻素含量的線性分析

方法的精密度、天麻素的穩(wěn)定性和回收率參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。樣本量與天麻素含量的線性分析參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.6 天麻生化指紋圖譜測(cè)定

采用優(yōu)化的參數(shù)(梯度濃度乙腈溶液、219 nm波長(zhǎng))和選定的基本色譜條件測(cè)定天麻樣本的生化指紋圖譜。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

樣本天麻素含量采用下式計(jì)算：

式中：YYH為單位質(zhì)量樣本的有效成分含量；YYM 為樣本有效成分峰面積；YDZ 為有效成分對(duì)照品的質(zhì)量；YDM 為有效成分對(duì)照品峰面積；YZ為樣本的質(zhì)量。

運(yùn)用中藥色譜指紋相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A，由中南大學(xué)設(shè)計(jì))計(jì)算樣本色譜指紋圖譜的相似系數(shù)。運(yùn)用SPSS11.5軟件(類平均聚類法)和相似系數(shù)構(gòu)建相似樹(shù)狀圖。根據(jù)相似樹(shù)狀圖對(duì)天麻種群進(jìn)行系統(tǒng)分類。采用非配對(duì)兩樣本平均數(shù)差異顯著性t檢驗(yàn)[16]，分析天麻類群之間的天麻素含量差異顯著性。根據(jù)平均天麻素含量和分離峰總面積對(duì)天麻樣本和種群的品質(zhì)進(jìn)行鑒定與評(píng)價(jià)。通過(guò)比較，闡明天麻生化指紋圖譜、有效成分含量和來(lái)源地的關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)優(yōu)良天麻品種和適宜種植地區(qū)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳流動(dòng)相的篩選

分別以10％乙腈溶液和梯度濃度乙腈溶液為流動(dòng)相，以221 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定天麻標(biāo)準(zhǔn)品的生化指紋圖譜，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 以10％乙腈溶液(A)、梯度濃度乙腈溶液(B)為流動(dòng)相的天麻標(biāo)準(zhǔn)品的生化指紋圖譜

由圖1可知，梯度濃度乙腈溶液比10％乙腈溶液的分離效果好。前者分離出18種成分，而后者只得到9種成分，而且分離效果差。這是由于10％乙腈對(duì)天麻化學(xué)成分具有很強(qiáng)的洗脫作用，洗脫速度過(guò)快。因此，選擇梯度濃度乙腈溶液為流動(dòng)相。

2.2 最佳檢測(cè)波長(zhǎng)的篩選

以優(yōu)選的梯度濃度乙腈溶液為流動(dòng)相，以221 nm、219 nm、217 nm、215 nm、213 nm 5種波長(zhǎng)測(cè)定天麻標(biāo)準(zhǔn)品的生化指紋圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，219 nm下獲得的天麻素峰面積(3次平均值，mAU*s)最高，為9565.9，其余分別為9528.3、9372.7、9101.3、8832.6，相對(duì)其降低了0.4％、2％、4.9％、7.7％，表明用219 nm波長(zhǎng)檢測(cè)天麻樣本能得到最大天麻素峰面積，檢測(cè)波長(zhǎng)增大或減小都會(huì)使天麻素峰面積減少。5種波長(zhǎng)下獲得的天麻各種生化成分總峰面積(mAU*s)分別為：48401.1、51671.6、54129.5、56964.1、59783.3。表明各種生化成分的總峰面積隨檢測(cè)波長(zhǎng)的減小而增加。綜合考慮，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為219 nm。

2.3 方法的精密度、天麻素穩(wěn)定性和回收率檢驗(yàn)

采用優(yōu)化參數(shù)和選定的色譜條件重復(fù)測(cè)定天麻標(biāo)準(zhǔn)品的天麻素含量5次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.41％。 分別于0 h、12 h、24 h、48 h、96 h測(cè)定天麻標(biāo)準(zhǔn)品的天麻素含量，不同時(shí)間測(cè)定結(jié)果的RSD為1.36％。將1 mL天麻素對(duì)照品(1 mg·mL-1)分別加入到5個(gè)已知天麻素含量的天麻樣本中，再測(cè)定其回收率，平均回收率為97.7％、RSD為2.6％。

2.4 樣本量與天麻素含量的線性關(guān)系

采用優(yōu)化參數(shù)和選定的色譜條件測(cè)定4 μL、8 μL、12 μL、16 μL和20 μL天麻標(biāo)準(zhǔn)品的天麻素含量。結(jié)果表明：樣本量x與天麻素含量y呈良好線性關(guān)系，擬合線性回歸方程為：y=0.40795x+0.3332,R=0.9998。

2.5 天麻的生化指紋圖譜測(cè)定

以梯度濃度乙腈溶液為流動(dòng)相、以219 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，在基本色譜條件下測(cè)定9種天麻樣本的生化指紋圖譜,選取有代表性的3類圖譜(其它圖譜未列出)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 湖北天麻(A)、云南天麻(B)、四川天麻(C)萃取物的生化指紋圖譜

由生化指紋圖譜可見(jiàn)，來(lái)自同一地區(qū)或不同地區(qū)的同類型天麻(根據(jù)聚類分析判斷)具有十分相似的生化指紋圖譜；來(lái)自不同地區(qū)的不同類型天麻具有不同形狀的生化指紋圖譜和不同數(shù)量的分離峰(15～21個(gè))。但所有天麻樣本都有8個(gè)共有特征峰，分別位于 1.29 min、2.70 min、4.88 min、5.44 min、5.83 min、6.37 min、6.60 min和7.09 min左右，平均RSD為1.36％，其中天麻素峰最穩(wěn)定(位于5.44 min左右)，其RSD 為0.36％。

2.6 天麻生化指紋圖譜的相似性分析和種群分類

運(yùn)用相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算天麻種群內(nèi)樣本之間的生化指紋圖譜相似系數(shù)和種群之間的生化指紋圖譜相似系數(shù)，見(jiàn)表1和表2。

運(yùn)用SPSS11.5軟件和表2中的相似系數(shù)構(gòu)建天麻相似樹(shù)狀圖，見(jiàn)圖3。

表1 天麻種群內(nèi)樣本之間生化指紋圖譜的相似系數(shù)

表2 9個(gè)天麻種群之間生化指紋圖譜的相似系數(shù)

圖3 9個(gè)天麻種群之間生化指紋圖譜的相似樹(shù)狀圖

根據(jù)相似樹(shù)狀圖可將9種天麻分成3個(gè)不同的類群：第Ⅰ類包括天麻標(biāo)準(zhǔn)品、湖南石門、湖北宜昌、安徽大別山、貴州大方、陜西略陽(yáng)、西藏察愚和吉林長(zhǎng)白山天麻，這一類天麻的生化指紋圖譜特征是：天麻素分離峰比其它所有成分的分離峰都高；第Ⅱ類包括云南彝良天麻，這一類天麻的指紋圖譜特征是：在2.4 min左右和7.0 min左右處有兩個(gè)高大的峰(分別占總峰面積的38.1％和25.2％)、而天麻素峰矮小(占總峰面積的5％左右)；第Ⅲ類包括四川涼山天麻，這一類天麻的指紋圖譜特征介于第Ⅰ類和第Ⅱ類之間，其2.4 min左右分離峰與Ⅱ類天麻的對(duì)應(yīng)峰一樣高，7.0 min左右分離峰比Ⅱ類天麻的對(duì)應(yīng)峰矮小，但其天麻素峰比Ⅱ類天麻的對(duì)應(yīng)峰高得多，接近Ⅰ類天麻對(duì)應(yīng)峰。

2.7 天麻種群的天麻素定量分析與評(píng)價(jià)

2.7.1 定量分析

根據(jù)樣本的天麻素峰面積，計(jì)算各種天麻樣本的平均天麻素含量，見(jiàn)表3。

表3 9種天麻的平均天麻素含量和分離峰總面積比較

由表3可知，湖北宜昌和湖南石門天麻的天麻素含量最高，分別達(dá)到7.52 mg·g-1、7.26 mg·g-1，其它成分含量也很高(根據(jù)其峰面積推算)；云南彝良天麻的天麻素含量最低，但其它成分含量很高。

統(tǒng)計(jì)和計(jì)算天麻各類群的平均天麻素含量和平均總峰面積，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3類天麻的平均天麻素含量和平均總峰面積的比較

由表4可知，第Ⅰ類天麻的天麻素含量最高，平均含量為(5.67±1.50)mg·g-1；第Ⅱ類天麻的天麻素含量最低，平均含量為(1.70±0.36)mg·g-1，但各種成分總峰面積最大，為(67199±7051) mAU*s；第Ⅲ類天麻的天麻素和其它成分含量與它的生化指紋圖譜一樣，介于第Ⅰ和第Ⅱ類之間。這說(shuō)明生化指紋圖譜與有效成分含量之間存在明顯的相關(guān)性。

采用非配對(duì)試驗(yàn)兩樣本均數(shù)差異顯著性t檢驗(yàn)，分析天麻各類群天麻素含量的差異顯著性。結(jié)果表明，第Ⅱ類天麻的天麻素含量與第Ⅰ類(t=3.621,df=22)和第Ⅲ類(t=2.630,df=5)相比具有顯著差異性(t>t0.05,P<0.05)，第Ⅰ類天麻的天麻素含量與第Ⅲ類相比沒(méi)有顯著差異(t=1.175，df=21，t0.05)。

2.7.2 天麻綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)

在第Ⅰ類天麻中，湖北宜昌和湖南石門天麻的平均天麻素含量最高，其它化學(xué)成分含量也很高，質(zhì)量最好。這可能與湖南西北部和湖北西南部相鄰山區(qū)的適宜氣候和土壤有關(guān)，說(shuō)明湖南石門至湖北宜昌之間的山區(qū)可能比較適宜種植天麻。盡管，吉林長(zhǎng)白山天麻與湖北和湖南天麻具有相似的遺傳特性(根據(jù)它們具有相似的生化指紋圖譜推斷)，但各種成分含量成比例減少。這可能與東北長(zhǎng)白山地區(qū)長(zhǎng)時(shí)間氣候寒冷有關(guān)。這種相關(guān)性在其它天然藥物研究中也有報(bào)道[17,18]。

目前已知，天麻塊莖含有天麻素、天麻苷元、香草醛、香草醇、倍半萜類、嘌呤類等多種生化成分，其中天麻素是其主要有效成分；天麻素含量高低是判斷天麻質(zhì)量的重要指標(biāo)[13～15]。根據(jù)天麻素含量和其它成分峰面積進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)：第Ⅰ類天麻質(zhì)量最好，因?yàn)槠涮炻樗睾孔罡?，其它成分含量也較高；第Ⅱ類天麻的天麻素含量最低，就天麻素含量而言，其質(zhì)量較差，但其它成分含量最高，有其特色；第Ⅲ類天麻質(zhì)量介于第Ⅰ類和第Ⅱ類之間。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)Ⅰ型生化指紋圖譜的天麻種群含有更多的天麻素，是優(yōu)良的天麻類群。

比較同種天麻不同大小樣本的天麻素含量，發(fā)現(xiàn)天麻個(gè)體大小與天麻素含量沒(méi)有必然聯(lián)系。但是，一般說(shuō)來(lái)，中等大小天麻含較多的天麻素和較多的其它成分。

2.8 方法評(píng)價(jià)

有幾種方法可用于同種藥用植物的分類。其中生化指紋圖譜分類具有明顯的優(yōu)勢(shì)：既能確定藥用植物的遺傳本質(zhì)，又能反映其基因表達(dá)的調(diào)控水平，還能直接觀察和確定其表型數(shù)量性狀的優(yōu)劣，具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

實(shí)際應(yīng)用效果表明，作者建立的生化指紋圖譜技術(shù)比以前報(bào)道的方法[15]要好，能有效地分離和檢測(cè)到天麻更多的生化成分和更高的天麻素含量(高2倍)，精密度高、重復(fù)性好、指紋圖譜清晰，可在更短的時(shí)間內(nèi)(1/6左右時(shí)間)完成檢測(cè)過(guò)程。

本方法可用于天麻真?zhèn)舞b定。如果被測(cè)樣本具有天麻的8個(gè)共有特征峰便是真正的天麻，否則，便是偽天麻。

3 結(jié)論

本研究建立的HPLC指紋圖譜測(cè)定方法是測(cè)定天麻生化指紋圖譜的優(yōu)化方法。根據(jù)生化指紋圖譜的相似性將9種天麻分成3類。表現(xiàn)Ⅰ型生化指紋圖譜的天麻含有更高的天麻素，是優(yōu)良的種類，其中來(lái)自湖北宜昌和湖南石門的天麻質(zhì)量最好，湖北宜昌至湖南石門之間的山區(qū)可能比較適宜種植天麻。天麻的生化指紋圖譜、有效成分含量和原產(chǎn)地三者之間存在明顯的相關(guān)性。本項(xiàng)目研究成果可應(yīng)用于天麻系統(tǒng)分類、質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種鑒定與選擇。

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