基于細(xì)胞性質(zhì)分析不同有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌C1,2脫氫反應(yīng)的影響

駱健美,宋 妍,王建鋒,寧 靜,成永新,鄭 宇,申雁冰

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué)) 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

微生物的C1,2位脫氫反應(yīng)是工業(yè)生產(chǎn)氫化潑尼松及其同系物最有價值的一類反應(yīng)，也是工業(yè)上采用發(fā)酵法生產(chǎn)甾體藥物的典型代表。甾體藥物母核C1,2位引入雙鍵后，能成倍地提高抗炎和抗過敏活性，副作用也更小[1，2]。在眾多具有C1,2位脫氫能力的微生物中，簡單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)以專一性高、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)成為研究和應(yīng)用較廣泛的菌株[3，4]。甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)中底物的難溶性是限制轉(zhuǎn)化反應(yīng)效率的重要瓶頸[5]。目前，工業(yè)上主要通過加入有機(jī)溶劑提高底物的溶解度，其中，甲醇、乙醇、二甲基亞砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)的應(yīng)用最為廣泛[6～10]。

研究者大多將有機(jī)溶劑加入后轉(zhuǎn)化反應(yīng)效率的提高歸結(jié)為底物的增溶作用。但事實(shí)上，添加有機(jī)溶劑后轉(zhuǎn)化反應(yīng)中微生物的各種生理性質(zhì)都會發(fā)生變化，進(jìn)而對轉(zhuǎn)化反應(yīng)產(chǎn)生影響。駱健美等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度乙醇對甾體C1,2脫氫反應(yīng)菌種——簡單節(jié)桿菌的結(jié)構(gòu)、生長和生理代謝產(chǎn)生影響。乙醇濃度的增大使得微生物的代謝活力和跨膜電位下降、細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，當(dāng)乙醇濃度為8％時，細(xì)胞完整性明顯被破壞。

作者以簡單節(jié)桿菌TCCC 11037催化醋酸可的松(CA)的C1,2脫氫反應(yīng)為模型，通過分析4種有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、DMSO和DMF加入后微生物的細(xì)胞存活率、生理代謝活力、細(xì)胞膜通透性及細(xì)胞完整性的變化，探討不同有機(jī)溶劑下轉(zhuǎn)化反應(yīng)效率產(chǎn)生差異的原因，擬為今后從細(xì)胞學(xué)特性方面加以改善，以進(jìn)一步建立提高有機(jī)介質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)效率的新方法提供理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 菌株

簡單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)TCCC 11037，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院微生物制藥研究室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

醋酸可的松(CA)及醋酸潑尼松(PA)標(biāo)準(zhǔn)品，天津市藥檢所；其它試劑及藥品均為市售分析純。

JSPM-5200型原子力顯微鏡；F-5301PC型熒光分光光度計；SBA-90型生物傳感儀；Agilent 1100 Series LC型高效液相色譜儀(G1314Pump，G1322ADEGASSER G1314VWD檢測器，20 μL AN進(jìn)樣器，Hp ChemStation)。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和菌體培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[12]配制。

1.2 方法

1.2.1 斜面培養(yǎng)

將接種的斜面培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱中30 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d。

1.2.2 種子培養(yǎng)

從斜面挑取1環(huán)菌種，接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在160 r·min-1、32 ℃下培養(yǎng)18 h。

1.2.3 二級培養(yǎng)

按5％(體積比)的接種量將上述種子培養(yǎng)液接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，在160 r·min-1、32 ℃下培養(yǎng)24 h。

1.2.4 醋酸可的松的生物轉(zhuǎn)化

向培養(yǎng)體系中分別添加4％(體積分?jǐn)?shù)，下同)的甲醇、乙醇、DMSO、DMF，然后干粉投料(投料比5％)，在160 r·min-1、32 ℃下進(jìn)行醋酸可的松的轉(zhuǎn)化，期間不斷取樣，測定轉(zhuǎn)化率和初始轉(zhuǎn)化速率并表征各種細(xì)胞性質(zhì)。以不加有機(jī)溶劑的培養(yǎng)體系為對照。

1.2.4.1 轉(zhuǎn)化率的測定

取500 μL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液，加入到1 mL乙酸乙酯中終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。取適量有機(jī)相揮干后，加入1 mL流動相重新溶解，用0.45 μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)樣20 μL，HPLC分析測定底物轉(zhuǎn)化率。由于樣品中只含有底物CA和產(chǎn)物PA，且兩者在240 nm下響應(yīng)面積非常接近，因此，可采用面積歸一化法檢測CA轉(zhuǎn)化率。

HPLC條件：色譜柱為Kromasil 100-5SIL(250 mm×4.6 mm)；流動相為二氯甲烷-乙醚-甲醇(86∶12∶2，體積比)，0.5 μm微孔濾膜過濾；流速1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長240 nm。

1.2.4.2 初始轉(zhuǎn)化速率的測定

菌體在分別添加4％的甲醇、乙醇、DMSO、DMF 4種有機(jī)溶劑的培養(yǎng)體系中進(jìn)行醋酸可的松的轉(zhuǎn)化，并于10 min后取樣測定底物初始轉(zhuǎn)化速率。反應(yīng)速率以單位時間單位轉(zhuǎn)化液體積中底物轉(zhuǎn)化量來表示，單位為mg·mL-1·min-1。

1.2.5 細(xì)胞存活率的測定

采用10倍逐級稀釋的方法于固體培養(yǎng)基平板中進(jìn)行活菌計數(shù)，32 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，統(tǒng)計每皿的菌落數(shù)(每個稀釋度做3個平行)。

1.2.6 糖代謝活力保留值(R)的測定

向離心收集后的菌體細(xì)胞中加入10 g·L-1葡萄糖水溶液10 mL，160 r·min-1、32 ℃下處理8 h后，取1 mL樣品，用生物傳感儀測定葡萄糖濃度。

1.2.7 超顯微結(jié)構(gòu)觀察

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液離心，洗滌2次后，將細(xì)胞固定在2.5％的戊二醛溶液中置于4 ℃冰箱過夜，將細(xì)胞濃度調(diào)至相同的菌懸液小心滴于蓋玻片上，待水分自然晾干，用原子力顯微鏡檢測。成像在大氣環(huán)境下進(jìn)行，掃描模式為輕敲模式。所有圖像均通過自動平滑和低通濾波處理以消除慢掃方向的低頻噪音。

1.2.8 細(xì)胞膜通透性的測定

FDA是一種不帶電荷的親脂性分子，本身不發(fā)熒光，但進(jìn)入細(xì)胞后可被胞內(nèi)脂肪酶水解產(chǎn)生熒光素。因此，可以利用熒光光度計檢測菌液熒光強(qiáng)度的大小表征細(xì)胞膜的通透性。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液離心，洗滌2次后，生理鹽水重懸，并將其OD600值調(diào)至0.8，此時細(xì)胞濃度約為1×107個·mL-1。FDA(最大激發(fā)波長492 nm，發(fā)射波長513 nm)用丙酮新鮮配制成濃度為2 mg·mL-1的貯備液，按1×107個·mL-1細(xì)胞加25 μL，使細(xì)胞終濃度為25 μg·mL-1，37 ℃水浴保存2 min后，檢測菌液熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌轉(zhuǎn)化醋酸可的松的影響

考察不同有機(jī)溶劑下簡單節(jié)桿菌轉(zhuǎn)化醋酸可的松的最終轉(zhuǎn)化率和初始轉(zhuǎn)化速率，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 不同有機(jī)溶劑下簡單節(jié)桿菌生物轉(zhuǎn)化醋酸可的松24 h的轉(zhuǎn)化率

由圖1可知，有機(jī)溶劑的加入有利于醋酸可的松的生物轉(zhuǎn)化，其中，添加乙醇時的最終轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到85.26％，其余由高到低依次為DMSO 80.215％、甲醇69.785％、DMF 67.217％。

圖2 不同有機(jī)溶劑下簡單節(jié)桿菌生物轉(zhuǎn)化醋酸可的松的初始轉(zhuǎn)化速率

由圖2可知，4種有機(jī)溶劑中，DMSO加入后，醋酸可的松的初始轉(zhuǎn)化速率最高，為2.089 mg·mL-1·min-1，其次為甲醇1.913 mg·mL-1·min-1，而乙醇和DMF加入后初始轉(zhuǎn)化速率比較接近，均與對照組相差不大。

2.2 不同有機(jī)溶劑對菌體存活率的影響(圖3)

圖3 不同有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌存活率的影響

菌體存活率反映不同有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌的毒害作用。由圖3可知，添加4種有機(jī)溶劑后，簡單節(jié)桿菌的細(xì)胞存活率均有不同程度的降低，其中DMF加入后細(xì)胞存活率下降速度最快，24 h時細(xì)胞存活率僅為2.50％；甲醇和乙醇的影響較小，24 h時細(xì)胞存活率分別為32.29％和25.10％，遠(yuǎn)高于DMF和DMSO。4種有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌的毒害作用由強(qiáng)到弱依次為DMF>DMSO>乙醇>甲醇。

2.3 不同有機(jī)溶劑對菌體糖代謝活力保留值的影響(圖4)

圖4 不同有機(jī)溶劑下簡單節(jié)桿菌的糖代謝活力保留值

糖代謝活力保留值(R)表征有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌生理代謝活力的影響。由圖4可知，有機(jī)溶劑存在時，菌體的糖代謝活力均大幅度降低，其中DMF處理時的R值最小，僅為18.49％；而乙醇和甲醇處理時菌體仍能保持較好的生理活性，其糖代謝活力保留值分別為25.34％和24.07％。這和不同有機(jī)溶劑對菌體存活率的影響基本一致。說明細(xì)胞生理代謝活力的變化直接決定了微生物在有機(jī)溶劑下的存活能力。

2.4 不同有機(jī)溶劑對菌體超顯微結(jié)構(gòu)的影響(圖5)

圖5 不同有機(jī)溶劑加入時簡單節(jié)桿菌的超顯微結(jié)構(gòu)

由圖5可知，未經(jīng)有機(jī)溶劑處理的簡單節(jié)桿菌細(xì)胞形狀較規(guī)則，多為短桿形，細(xì)胞膜光滑完整。有機(jī)溶劑處理后菌體的細(xì)胞完整性和表面形態(tài)受到一定程度影響。其中，4％DMSO處理后的細(xì)胞出現(xiàn)了一定程度的收縮，部分細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷；4％甲醇和4％乙醇處理后的細(xì)胞長徑的收縮更加嚴(yán)重，能觀察到胞漿流出；4％DMF處理后的細(xì)胞大小無明顯改變，但個別細(xì)胞的形狀出現(xiàn)不規(guī)則變化，部分細(xì)胞表面有小體產(chǎn)生。由此可知，甲醇和乙醇的處理使細(xì)胞的完整性受到的影響較大。

2.5 不同有機(jī)溶劑對菌體細(xì)胞膜通透性的影響(圖6)

圖6 不同有機(jī)溶劑對細(xì)胞膜通透性的影響

由圖6可知，添加DMSO、DMF、甲醇、乙醇時細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為對照組的108.297％、101.967％、116.366％、110.117％，這說明4種有機(jī)溶劑的加入都使細(xì)胞膜通透性增大。其中，甲醇和乙醇處理時細(xì)胞膜通透性增大較為明顯，而DMF對細(xì)胞膜通透性的影響最小。進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞完整性的觀察結(jié)果，說明4種有機(jī)溶劑中，甲醇和乙醇對細(xì)胞完整性和膜通透性的影響較為顯著。

3 結(jié)論

乙醇、DMF、DMSO、甲醇等4種有機(jī)溶劑加入后，簡單節(jié)桿菌生物轉(zhuǎn)化醋酸可的松的C1,2脫氫反應(yīng)過程的初始轉(zhuǎn)化速率和最終轉(zhuǎn)化率均有所提高。但不同有機(jī)溶劑下菌體的初始轉(zhuǎn)化速率差異不大，而最終轉(zhuǎn)化率存在明顯差異。其中，轉(zhuǎn)化率從高到低依次為乙醇>DMSO>甲醇>DMF。4種有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌細(xì)胞存活率和代謝活力的影響趨勢基本一致，其中DMF的影響最大，DMSO次之，乙醇和甲醇影響較小。4種有機(jī)溶劑中，甲醇對簡單節(jié)桿菌細(xì)胞完整性的影響最大，乙醇次之，DMF和DMSO差別不明顯；4種有機(jī)溶劑對簡單節(jié)桿菌細(xì)胞膜通透性的影響大小依次為甲醇>乙醇>DMSO>DMF。通過上述細(xì)胞性質(zhì)的分析，可以認(rèn)為，4種不同有機(jī)溶劑加入時，細(xì)胞生理代謝活力和細(xì)胞膜通透性的差異是造成轉(zhuǎn)化率水平不同的重要原因。其中，細(xì)胞膜通透性的增強(qiáng)有利于底物分子更容易進(jìn)入細(xì)胞與生物酶接觸，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化率。綜合考慮，乙醇是較為適合的有機(jī)溶劑。

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