滸苔硒多糖的制備及其活性研究

高玉杰，呂海濤

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

滸苔(Enteromorphaprolifera)是綠藻門、綠藻綱、石莼目、滸苔屬的藻類植物，是一種重要的經(jīng)濟(jì)海藻，俗稱海青菜、苔菜、苔條，為食用和藥用藻類?！侗静菥V目》記載滸苔可“燒末吹鼻止衄血，湯浸搗敷手背腫痛”；《隱身居飲食譜》記載：“清膽，消瘰疬癭瘤，瀉脹，化痰，治水土不服”[1]。多糖是滸苔的主要活性物質(zhì)之一，研究表明，滸苔多糖具有顯著的降血糖和血膽固醇、抑制Ehrlich癌和皮膚癌的活性[2～4]。

硒是人體必需的微量元素，具有清除自由基、提高人體免疫能力、抗癌等作用[5，6]，另外，還可治療克山病和大骨節(jié)病，并用于提高視力和防治肝壞死等疾病[7，8]。硒多糖具有硒與多糖的雙重功效，有獨特的生物活性，在抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等方面發(fā)揮著越來越重要的作用[9～12]，已成為研究的熱點。

作者選取滸苔為原料提取滸苔多糖(EP)，并硒化得到滸苔硒多糖(Se-EP)，采用HPLC對其進(jìn)行了單糖組成分析，并研究了滸苔硒多糖的活性，擬為開發(fā)新的抗衰老保健品等提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

滸苔采于青島匯泉灣海域。

木瓜蛋白酶(65萬U·g-1)，廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，Sigma公司；乙腈(色譜純)，天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；硝酸、乙醇、硫酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、水楊酸、三氯乙酸、FeSO4、H2O2、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純；實驗用水為二次去離子水。

90-2型醫(yī)用低速離心機(jī)、DF-Ⅱ型集熱式恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇恒豐儀器廠；AR2140型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SP-754型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；TAS-986型原子吸收分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LC-10ATvp型液相色譜儀(配有可變波長紫外可見檢測器和浙江大學(xué)N2000色譜數(shù)據(jù)工作站)，島津公司；Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，安捷倫科技公司。

1.2 滸苔硒多糖的制備

1.2.1 滸苔多糖的提取

取脫脂后的滸苔干粉用熱水浸提，冷卻，調(diào)pH值至5.5，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8％的木瓜蛋白酶脫蛋白后，經(jīng)乙醇醇沉，得滸苔粗多糖(純度為49.13％)。

1.2.2 滸苔硒多糖制備的單因素實驗[13]

精確稱取0.1 g滸苔粗多糖放入三口燒瓶中，加入10 mL 0.5％(體積分?jǐn)?shù))的硝酸溶液，加熱攪拌使其全部溶解，得10 mg·mL-1的多糖溶液。按亞硒酸鈉與多糖質(zhì)量比(原料配比，下同)1∶1加入亞硒酸鈉，加熱攪拌，于70 ℃反應(yīng)7 h，冷卻，過濾，離心除去沉淀，溶液用流水透析，取少量透析液加入抗壞血酸檢測亞硒酸鈉的殘留，無血紅色時停止透析，真空冷凍干燥，即得滸苔硒多糖。

固定其它條件不變，依次改變原料配比(0.5∶1、1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1)、反應(yīng)時間(3 h、6 h、7 h、8 h、9 h)、反應(yīng)溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、硝酸體積分?jǐn)?shù)(0.3％、0.5％、1.0％、1.5％)，考察各因素對硒多糖中硒含量的影響。

1.2.3 滸苔硒多糖制備的正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以硒多糖中硒含量為評價指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交實驗，以確定最佳合成工藝。正交實驗的因素和水平見表1。

表1 滸苔硒多糖制備的正交實驗的因素與水平

1.3 分析與測試

1.3.1 硒含量的測定

1.3.1.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取亞硒酸鈉0.1000 g置于100 mL燒杯中，加入濃硝酸10 mL。溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，即得硒標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精確量取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液10 mL，用超純水定容到1000 mL，得到濃度為10 μg·mL-1的母液。分別取母液0 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL，定容到10 mL，得Se濃度(μg·mL-1)分別為0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00的溶液，用原子吸收分光光度計測定吸光度值(測定波長為196.1 nm，光譜帶寬為0.4 nm)。以亞硒酸鈉溶液濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。擬合回歸方程為：A=0.1638c+0.0059，相關(guān)系數(shù)為0.9962。

1.3.1.2 樣品中硒含量的測定

取滸苔硒多糖樣品，用超純水溶解，定容至25 mL，測定吸光度值，根據(jù)回歸方程計算其中硒的含量。

1.3.2 單糖組成分析[14，15]

用硫酸將滸苔硒多糖水解成單糖，將水解后的滸苔硒多糖樣品液、混合單糖(D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖和D-木糖5種單糖)標(biāo)準(zhǔn)液經(jīng)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化后，0.45 μm微孔濾膜濾過，進(jìn)樣20 μL，HPLC分離檢測。

色譜條件：色譜柱為Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；洗脫液為乙腈-pH值6.8的醋酸銨緩沖溶液(14∶86，體積比)；流速1 mL·min-1；檢測波長245 nm。

1.3.3 光譜分析

1.3.3.1 紫外可見光譜

配制0.5 mg·mL-1的滸苔硒多糖溶液(溶液呈透明狀)，以蒸餾水為空白，在190～900 nm范圍內(nèi)掃描紫外可見光譜。

1.3.3.2 紅外光譜

取一定量的滸苔硒多糖固體粉末，KBr壓片，在4000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.4 抗氧化活性的測定

1.3.4.1 對有機(jī)自由基DPPH的清除作用[16]

配制0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1的滸苔多糖溶液和滸苔硒多糖溶液。分別取2 mL，加入3 mL 0.016 mg·mL-1的DPPH·醇溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，充分混合，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測定各反應(yīng)溶液的吸光度，實驗設(shè)3個組：樣品組(加入樣品溶液)、對照組(不加樣品溶液)、本底組(樣品本身)。自由基清除率按下式計算：

式中：A0、A1、A2分別為對照組、樣品組、本底組的吸光度值。

1.3.4.2 對羥自由基(·OH)的清除作用[17]

采用Fenton反應(yīng)體系測定硒化前后滸苔多糖對·OH 的清除作用。配制1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、3.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1、7.0 mg·mL-1的滸苔多糖溶液和滸苔硒多糖溶液。分別取1 mL 9 mmol·L-1FeSO4溶液、1 mL 9 mmol·L-1水楊酸的乙醇溶液和1 mL 8.8 mmol·L-1H2O2，加入上述配制好的樣品待測液各2 mL，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，以蒸餾水作空白，在510 nm處測定各反應(yīng)溶液的吸光度。實驗設(shè)3個組：樣品組、對照組、本底組。自由基清除率計算方法同1.3.4.1。

1.3.4.3 還原能力的測定[18]

配制0 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、2.0 mg·mL-1、4.0 mg·mL-1、6.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1的滸苔多糖溶液和滸苔硒多糖溶液。分別取1 mL，依次加入2.5 mL 0.2 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液(pH值 6.74)和2.5 mL 0.01 g·mL-1的鐵氰化鉀溶液，混合均勻后，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min，然后加入2.5 mL 0.1 g·mL-1的三氯乙酸溶液，混合均勻，離心10 min。移取2.5 mL上清液于另一試管中，加入2.5 mL蒸餾水和5 mL 0.001 g·mL-1三氯化鐵溶液，混合均勻后，在700 nm處測定其吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 滸苔硒多糖合成工藝的優(yōu)化

2.1.1 單因素實驗結(jié)果與分析(圖1)

圖1 原料配比(a)、反應(yīng)時間(b)、反應(yīng)溫度(c)和硝酸體積分?jǐn)?shù)(d)對硒含量的影響

由圖1可知，隨著原料配比的增大，硒含量先上升后下降，在原料配比為1.0∶1時，硒含量最高；隨著反應(yīng)時間的延長，硒含量呈上升趨勢，但反應(yīng)時間超過8 h以后，硒含量升幅趨緩；隨著反應(yīng)溫度的升高，硒含量先上升后下降，在反應(yīng)溫度為60 ℃時，硒含量最高，這是由于溫度過高導(dǎo)致部分多糖發(fā)生降解，使硒含量降低；隨著硝酸體積分?jǐn)?shù)的增大，硒含量先上升后下降，在硝酸體積分?jǐn)?shù)為0.5％時，硒含量最高。

2.1.2 正交實驗結(jié)果與分析

正交實驗的結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交實驗結(jié)果與分析

由表2可知，各因素對滸苔硒多糖硒含量的影響大小依次為C>D>A>B，即反應(yīng)溫度>硝酸體積分?jǐn)?shù)>原料配比>反應(yīng)時間，最佳合成工藝為A2B3C2D2，即原料配比1.0∶1、反應(yīng)時間8 h、反應(yīng)溫度60 ℃、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.5％。

表3 正交實驗結(jié)果方差分析

由表3可以看出，4個實驗因素對合成滸苔硒多糖的硒含量在統(tǒng)計學(xué)上均無顯著影響。

2.1.3 驗證實驗

按上述最佳工藝條件合成滸苔硒多糖，平行測定3次，滸苔硒多糖的平均硒含量為512.3 μg·g-1(RSD=1.33％)，高于正交實驗所測得的最高含量，表明所確定的最佳合成工藝條件可行。

2.2 單糖組成分析

經(jīng)衍生化反應(yīng)后，滸苔硒多糖樣品、混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜如圖2所示。

1.D-甘露糖 2.L-鼠李糖 3.D-半乳糖醛酸 4.D-葡萄糖 5.D-木糖

由圖2可以確定滸苔硒多糖由D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖和D-木糖5種單糖組成。進(jìn)一步由面積歸一化法計算得到滸苔硒多糖中上述單糖物質(zhì)的量比為0.01∶0.80∶0.12∶0.65∶0.09。

2.3 滸苔硒多糖的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外可見光譜

2.3.2 紅外光譜(圖3)

圖3 滸苔多糖和滸苔硒多糖的紅外光譜

由圖3可知，硒化前后滸苔多糖的紅外光譜相差不大，多糖的特征吸收峰未發(fā)生變化，不同的是滸苔硒多糖在786.78 cm-1附近出現(xiàn)了亞硒酸酯中Se=O雙鍵的特征吸收峰，在453.46 cm-1附近出現(xiàn)了Se-C鍵的特征吸收峰。說明硒化后形成了新的化學(xué)鍵，即存在亞硒酸酯基團(tuán)和Se-C鍵，而不是游離的亞硒酸根。這和紫外可見光譜分析結(jié)果一致，均說明硒與滸苔多糖得到了有效的結(jié)合。

2.4 滸苔硒多糖的抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的有機(jī)自由基，在517 nm處有最大吸收，其醇溶液呈紫色，當(dāng)有抗氧化劑存在時，生成DPPH-H分子，顏色會變淺，吸光度值變小，而吸光度值的變化程度與清除DPPH自由基的程度呈定量關(guān)系，可以反映樣品的抗氧化活性。滸苔多糖和滸苔硒多糖對DPPH自由基的清除效果如圖4所示。

圖4 滸苔多糖和滸苔硒多糖對DPPH自由基的清除效果

由圖4可知，在較低濃度范圍內(nèi)，滸苔多糖和滸苔硒多糖對DPPH的清除能力都較弱；隨著濃度的增大，DPPH清除率逐漸提高；當(dāng)濃度超過3.0 mg·mL-1時，滸苔硒多糖清除DPPH能力明顯強(qiáng)于滸苔多糖；在實驗濃度范圍內(nèi)，滸苔硒多糖的DPPH清除率最高達(dá)51.6％，而滸苔多糖的DPPH清除率最高為40.13％。表明硒化后滸苔多糖對DPPH自由基的清除能力有所提高。另外，通過實驗測得VC濃度為0.04 mg·mL-1時的DPPH清除率即可達(dá)52％，說明滸苔多糖和滸苔硒多糖對DPPH的清除能力不及VC。

2.4.2 對羥自由基(·OH)的清除作用

測定原理主要是FeSO4與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH，以·OH氧化水楊酸所得產(chǎn)物的吸光度值表示·OH的多少，吸光度值越大，·OH越多。滸苔多糖和滸苔硒多糖對羥自由基(·OH)的清除效果如圖5所示。

圖5 滸苔多糖和滸苔硒多糖對羥自由基(·OH)的清除效果

由圖5可知，滸苔多糖和滸苔硒多糖對羥自由基都有一定的清除能力，且呈現(xiàn)正相劑量關(guān)系；在實驗濃度范圍內(nèi)，對羥自由基的清除率可達(dá)80％左右。另外，測得滸苔硒多糖的EC50為3.93 mg·mL-1、滸苔多糖的EC50為3.86 mg·mL-1，表明兩者清除·OH的能力相差不大。

2.4.3 還原能力

樣品可將鐵氰化鉀還原成亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再與Fe3+作用生成亞鐵氰化鐵，在700 nm處檢測的吸光度表示待測物質(zhì)還原能力的大小，吸光度值越大，樣品的還原能力越強(qiáng)。

滸苔多糖、滸苔硒多糖的還原能力如圖6所示。

圖6 滸苔多糖和滸苔硒多糖的還原能力

由圖6可知，在實驗濃度范圍(1.0～10.0 mg·mL-1)內(nèi)，滸苔硒多糖的吸光度明顯高于滸苔多糖，說明滸苔硒多糖的還原能力優(yōu)于滸苔多糖。另外，實驗測得VC濃度為0.03 mg·mL-1時的吸光度值為0.253，說明滸苔多糖和滸苔硒多糖的還原能力低于VC的還原能力，但仍可能具有一定的抗氧化作用。Siddhuraju等[20]研究表明，樣品的抗氧化活性在一定程度上與其還原能力相關(guān)。本實驗中，滸苔硒多糖還原能力的提高可能與其中的硒元素有關(guān)。

3 結(jié)論

(1)利用自制的滸苔多糖和亞硒酸鈉在硝酸催化下合成滸苔硒多糖的最佳條件為：亞硒酸鈉與滸苔多糖的質(zhì)量比1.0∶1、反應(yīng)時間8 h、反應(yīng)溫度60 ℃、硝酸體積分?jǐn)?shù)0.5％，在此條件下合成的滸苔硒多糖的硒含量為512.3 μg·g-1。其單糖組成為D-甘露糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸∶D-葡萄糖∶D-木糖=0.01∶0.80∶0.12∶0.65∶0.09(物質(zhì)的量比)。

(2)紫外可見光譜、紅外光譜分析表明，滸苔硒多糖中含有亞硒酸酯基團(tuán)。

(3)滸苔硒多糖與滸苔多糖相比，清除有機(jī)自由基DPPH能力明顯提高，還原能力也更好，但清除·OH的能力變化不大。

(4)將滸苔多糖與硒結(jié)合，提高了多糖產(chǎn)品的生物活性，可為研制新型的抗衰老保健品或藥物提供理論參考，滸苔硒多糖的體內(nèi)活性有待于進(jìn)一步研究。

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