青霉纖維素酶酶解蘆竹的研究

葉艷平,周玉杰,丁一剛,劉 靖,張建安

(1.武漢工程大學(xué) 綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430073;2.清華大學(xué) 核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084)

纖維素酶為誘導(dǎo)型復(fù)合酶系，是生物降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱，主要由葡聚糖內(nèi)切酶(Cx酶)、葡聚糖外切酶(C1酶)、β-葡萄糖苷酶(CB酶)組成[1,2]，其中前兩者將纖維分解成纖維二糖，后者將纖維二糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖，當(dāng)三者的活性比例適當(dāng)時(shí)，就能有效地協(xié)同完成對(duì)纖維素的降解[3,4]。國(guó)內(nèi)外對(duì)木霉纖維素酶研究較多[5,6]，但該酶系普遍存在著β-葡萄糖苷酶活力很低的缺陷，致使纖維二糖積累，影響了酶解效率。相對(duì)于木霉屬的微生物而言，青霉屬(Penicillium)真菌不僅能分泌較全的降解天然木質(zhì)纖維材料的聚糖酶系，而且能產(chǎn)生較多的β-葡萄糖苷酶[7,8]。

作者在此以蒸汽爆破預(yù)處理后的蘆竹為原料，研究青霉纖維素酶酶解蘆竹的適宜條件，同時(shí)探討了向青霉纖維素酶中添加一定量的商業(yè)酶后的酶解效果，擬為利用蘆竹糖化發(fā)酵制取燃料乙醇和丁醇提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

蒸汽爆破預(yù)處理后蘆竹，其組分為：纖維素46％，半纖維素8％，木質(zhì)素33％，灰分13％。

青霉纖維素酶液，自制。

商業(yè)纖維素酶：NS50013(70 FPU·mL-1DM)、NS50010(250 CBU·mL-1DM)，諾維信公司；木聚糖酶(Xylanase)。

1.2 纖維素酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)

在50 mL三角瓶中，取蒸汽爆破預(yù)處理后蘆竹使其底物質(zhì)量濃度為2％，加入5 mL 1 mol·L-1醋酸緩沖溶液和一定量纖維素酶，在一定轉(zhuǎn)速恒溫?fù)u床中于45 ℃、pH值4.8、酶載量30 FPU·g-1DM條件下酶解72 h。離心，取上清液適當(dāng)稀釋?zhuān)瑴y(cè)定還原糖濃度。

固定其它反應(yīng)條件，依次改變酶解時(shí)間(12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h)、酶解溫度(30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、60 ℃)、pH值(3.5、4.0、4.8、5.6、6.5)、酶載量(10 FPU·g-1DM、20 FPU·g-1DM、30 FPU·g-1DM、40 FPU·g-1DM、50 FPU·g-1DM)，考察各因素對(duì)酶解效果的影響。

1.3 混合商業(yè)酶酶解實(shí)驗(yàn)

1.3.1 外加木聚糖酶單因素實(shí)驗(yàn)

添加木聚糖酶混合至酶液總木聚糖酶酶活(IU·g-1DM)依次達(dá)到：140、150、160、170、180、190、200，酶解蘆竹后測(cè)定其還原糖含量。

1.3.2 外加NS50010酶液?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn)

添加NS50010酶液混合至酶液總β-葡萄糖苷酶酶活(CBU·g-1DM)依次達(dá)到：10、20、30、40、60、90、150，酶解后測(cè)定其還原糖含量。

1.3.3 酶解效果對(duì)比

就以下不同酶系的酶解效果進(jìn)行對(duì)比：30 FPU·g-1DM青霉纖維素酶(酶系1)、30 FPU·g-1DM青霉纖維素酶加木聚糖酶至180 IU·g-1DM(酶系2)、30 FPU·g-1DM青霉纖維素酶加NS50010至β-葡萄糖苷酶40 CBU·g-1DM(酶系3)、30 FPU·g-1DM NS50013酶(酶系4)。

1.4 酶活測(cè)定

酶活力測(cè)定采用NREL推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法[9]。一個(gè)濾紙酶活力的國(guó)際單位(FPU)等于在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘釋放1 μmol葡萄糖的酶量。葡聚糖內(nèi)切酶酶活用羧甲基纖維素(CMC)測(cè)定；β-葡萄糖苷酶酶活用水楊素試劑測(cè)定；木聚糖酶酶活用木聚糖溶液測(cè)定。

1.5 還原糖含量測(cè)定

采用LC-20D型高效液相色譜儀測(cè)定酶液中的還原糖，如葡萄糖、木糖等的含量。色譜條件：色譜柱為HPX-87H有機(jī)酸分析柱，柱溫65 ℃，流動(dòng)相為5 mmol·L-1稀硫酸，流速0.8 mL·min-1,檢測(cè)器RID-10A。

2 結(jié)果與討論

2.1 各纖維素酶酶活比較

比較發(fā)現(xiàn)，不同纖維素酶的酶活和酶系組成都各不相同，青霉纖維素酶的β-葡萄糖苷酶酶活偏低，僅為0.9 CBU·mL-1，其濾紙酶酶活、木聚糖酶酶活、CMC酶活分別為5.2 FPU·mL-1、42.5 IU·mL-1、15.4 U·mL-1；Xylanase的木聚糖酶酶活較高，為2503.2 IU·mL-1，且檢測(cè)不到其它酶活性;NS50013的濾紙酶酶活和NS50010的β-葡萄糖苷酶酶活較高，分別為70 FPU·mL-1DM和250 CBU·mL-1DM。

2.2 青霉纖維素酶酶解蘆竹工藝條件優(yōu)化

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響(圖1)

圖1 酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

由圖1可知，酶解初期(1～12 h)反應(yīng)速度較快，還原糖產(chǎn)率迅速上升；隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速度急劇下降；酶解時(shí)間超過(guò)72 h后，還原糖產(chǎn)率提高不明顯。其原因可能是：當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到72 h后，酶與底物的反應(yīng)變緩、酶的活性降低，還原糖的生成趨緩。故選取適宜的酶解時(shí)間為72 h。

2.2.2 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響(圖2、圖3)

圖2 酶解溫度對(duì)酶解效果的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，還原糖產(chǎn)率逐漸上升；酶解溫度為45 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后迅速降低。其原因可能是：酶解溫度升高時(shí)，酶解液中活化分子數(shù)增多,反應(yīng)速度加快；但酶解溫度升至一定程度后,酶蛋白逐漸變性甚至失活,使反應(yīng)速度降低甚至很快結(jié)束。

圖3 不同溫度下葡萄糖產(chǎn)率隨酶解時(shí)間的變化

由圖3可知，50 ℃和60 ℃下的葡萄糖產(chǎn)率從12 h起即保持幾乎不變，即其反應(yīng)在12 h左右時(shí)即將近結(jié)束。45 ℃下的葡萄糖終產(chǎn)率最高。

綜合上述分析，選取適宜的酶解溫度為45 ℃。

2.2.3 pH值對(duì)酶解效果的影響(圖4)

圖4 pH值對(duì)酶解效果的影響

由圖4可知，酶解效果在pH值4.0～5.5之間較好，這是由纖維素酶蛋白對(duì)pH值的敏感性所決定的，其中pH值為4.8時(shí)酶解效果最好。因此，選取適宜的pH值為4.8。

2.2.4 酶載量對(duì)酶解效果的影響(圖5、圖6)

圖5 酶載量對(duì)酶解效果的影響

由圖5可知，隨著酶載量的增加，葡萄糖的產(chǎn)率明顯上升；當(dāng)酶載量超過(guò)30 FPU·g-1DM后，葡萄糖的升幅趨緩，最高葡萄糖產(chǎn)率約66.4％。當(dāng)酶載量持續(xù)增大時(shí),酶解后底物的pH值急劇降低,不利于后期生產(chǎn)。

圖6 不同酶載量下葡萄糖產(chǎn)率隨酶解時(shí)間的變化

由圖6可知，當(dāng)酶載量在40 FPU·g-1DM和50 FPU·g-1DM時(shí)，隨著酶解的進(jìn)行，葡萄糖產(chǎn)率開(kāi)始有起伏波動(dòng)甚至出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。綜合考慮酶解效果和成本因素，選取適宜的酶載量為30 FPU·g-1DM。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)分析，確定青霉纖維素酶酶解蘆竹的最適條件為：酶解時(shí)間72 h、酶解溫度45 ℃、pH值4.8、酶載量30 FPU·g-1DM，在此條件下，葡萄糖產(chǎn)率為(61.75±1.22)％、木糖產(chǎn)率為(40.07±6.88)％。

2.3 混合纖維素酶和商業(yè)酶酶解效果對(duì)比

2.3.1 外加木聚糖酶酶載量對(duì)酶解效果的影響(圖7)

圖7 外加木聚糖酶酶載量對(duì)酶解效果的影響

由圖7可知，隨著木聚糖酶酶載量的增加，還原糖產(chǎn)率明顯上升；木聚糖酶酶活為180 IU·g-1DM時(shí)，還原糖產(chǎn)率最高，此后葡萄糖產(chǎn)率略有下降，木糖產(chǎn)率明顯下降。最高的葡萄糖產(chǎn)率為69.82％、木糖產(chǎn)率為60.50％，相對(duì)于單獨(dú)青霉纖維素酶酶解的最高葡萄糖產(chǎn)率62.97％和木糖產(chǎn)率46.95％，分別提高6.85％和13.55％。

2.3.2 外加NS50010酶載量對(duì)酶解效果的影響(圖8)

圖8 外加NS50010酶載量對(duì)酶解效果的影響

由圖8可知，隨著外加NS50010酶載量的增加，葡萄糖的產(chǎn)率逐漸上升、木糖產(chǎn)率迅速上升；當(dāng)酶載量為40 CBU·g-1DM時(shí)，葡萄糖產(chǎn)率和木糖產(chǎn)率均達(dá)到最高；此后再增加NS50010酶載量，葡萄糖產(chǎn)率幾乎不變、木糖產(chǎn)率略有下降。最高的葡萄糖產(chǎn)率為68.96％、木糖產(chǎn)率為98.16％，相對(duì)于單獨(dú)青霉纖維素酶酶解的最高葡萄糖產(chǎn)率62.97％和木糖產(chǎn)率46.95％，分別提高5.99％和51.21％。添加NS50010時(shí)木糖產(chǎn)率顯著提高，且高于添加木聚糖酶的效果，其原因可能為：青霉纖維素酶中木聚糖酶酶活與濾紙酶酶活比例已達(dá)到一定理想值，單獨(dú)添加木聚糖酶提高該比例只能一定程度上提高酶解效率；而青霉纖維素酶中β-葡萄糖苷酶酶活與濾紙酶酶活比例較低，當(dāng)添加一定的NS50010提高該比例后，有效地提高了各酶之間的協(xié)同作用，從而得到較好的酶解效果。

2.3.3 不同酶酶解效果對(duì)比(圖9)

圖9 不同酶的酶解效果對(duì)比

由圖9可知，青霉纖維素酶加NS 50010 至β-葡萄糖苷酶40 CBU·g-1DM(酶系3)時(shí)木糖產(chǎn)率最高，為98.16％，高于單獨(dú)30 FPU·g-1DM NS50013(酶系4)的84.88％。補(bǔ)加木聚糖酶(酶系2)或NS50010(酶系3)，均能提高葡萄糖產(chǎn)率，且接近商業(yè)酶NS50013單獨(dú)酶解效果。故通過(guò)調(diào)節(jié)酶系中不同酶活比例，可以達(dá)到較好的協(xié)同作用，并獲得較好的酶解效果。

3 結(jié)論

(1)青霉纖維素酶酶解蘆竹的最適條件為：酶解時(shí)間72 h、酶解溫度45 ℃、pH值4.8、酶載量30 FPU·g-1DM，在此條件下，葡萄糖產(chǎn)率為(61.75±1.22)％、木糖產(chǎn)率為(40.07±6.88)％。

(2)通過(guò)添加不同商業(yè)酶如木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶，調(diào)節(jié)纖維素酶酶系中不同酶活比例，可一定程度上提高酶解效率。當(dāng)添加β-葡萄糖苷酶至40 CBU·g-1DM時(shí)，葡萄糖產(chǎn)率達(dá)68.96％、木糖產(chǎn)率達(dá)98.16％。

參考文獻(xiàn)：

[1]王超,章超樺.酶解纖維素類(lèi)物質(zhì)生產(chǎn)燃料酒精的研究進(jìn)展[J].纖維素科學(xué)與技術(shù)，2003,11(3)：52-59.

[2]武秀琴.纖維素酶及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)雜志，2009,29(2)：89-92.

[3]Kumar Rajeev,Wyman Charles E.Effects of cellulase and xylanase enzymes on the deconstruction of solids from pretreatment of poplar by leading technologies[J].Biotechnology Progress，2009，25(2)：302-314.

[4]Saha Badal C，Cotta Michael A.Lime pretreatment，enzymatic saccharification and fermentation of rice hulls to ethanol[J].Biomass and Bioenergy，2008，32(10)：971-977.

[5]Xia Liming，Shen Xueliang.High-yield cellulase production byTr-ichodermareeseiZU-02 on corn cob residue[J].Bioresource Technology，2004，91(3)：259-262.

[6]Krisztina Kovács，George Szakacs，Guido Zacchi.Comparative enzymatic hydrolysis of pretreated spruce by supernatants，whole fermentation broths and washed mycelia ofTrichodermareeseiandTrichodermaatroviride[J].Bioresource Technology,2009,100(3)：1350-1357.

[7]孫憲昀,曲音波,劉自勇.青霉木質(zhì)纖維素降解酶系研究進(jìn)展[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2007，13(5)：736-740.

[8]Jorgensen Henning，Morkeberg Astrid，Krogh Kristian B R，et al.Production of cellulases and hemicellulases by threePenicilliumspecies：Effect of substrate and evaluation of cellulose adsorption by capillary electrophoresis[J].Enzyme and Microbial Technology，2005，36(1)：42-48.

[9]Ghose T K.Measurement of cellulase activities[J].Pure and Applied Chemistry，1987，59(2)：257-268.