血管活性腸肽的固相合成及其體外抗菌活性研究

徐春蘭,尚曉婭，牛衛(wèi)寧，欽傳光

(西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710072)

抗菌肽是一類具有廣譜抗菌活性(抗細(xì)菌、病毒和真菌)的小分子量的陽(yáng)離子蛋白質(zhì)[1]；而神經(jīng)肽是一類在調(diào)節(jié)神經(jīng)源性炎癥中發(fā)揮重要作用的神經(jīng)遞質(zhì)[2]，具有與抗菌肽相似的大小、電荷、等電點(diǎn)和氨基酸組成，從而表現(xiàn)出直接的抗菌效應(yīng)。神經(jīng)系統(tǒng)可能將作為抗菌劑的神經(jīng)肽快速準(zhǔn)確地遞送到神經(jīng)支配的位點(diǎn)如口腔。研究表明，神經(jīng)肽如P物質(zhì)、神經(jīng)激肽A(NKA)、人降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)、神經(jīng)肽Y(NPY)和血管活性腸肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)等存在于人正常和齲壞牙齒的牙髓、齦溝液和唾液中[3～5]。

VIP，又名舒血管腸肽，為直鏈肽，屬胰高血糖素-胰泌素家族，在人體內(nèi)分布較廣，不僅是胃腸道激素，同時(shí)又是一種神經(jīng)肽。許多免疫活性細(xì)胞不僅能釋放少量的VIP，而且其表面上也有與VIP高親和力的受體存在。研究表明，VIP是神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間相互作用的一種信號(hào)分子，在機(jī)體免疫、尤其是在局部粘膜免疫中起著一定的作用；VIP對(duì)消化道運(yùn)動(dòng)起抑制性調(diào)節(jié)作用；VIP可以直接殺死各種細(xì)菌和酵母菌，是一種潛在的抗菌肽[6～8]。因此，研究VIP的合成及活性意義重大。

作者采用Na-芴甲氧羰基(Fluorenylmethyloxyloxycarbonyl，F(xiàn)MOC)作為α-氨基的保護(hù)基，以固相合成法合成VIP，并對(duì)其體外抗菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

受試菌株：大腸埃希菌(EscherichiacoliATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 25923)、變形鏈球菌(StreptococcusmutansATCC 25175)、糞腸球菌(EnterococcusfaecalisATCC 29212)、銅綠假單胞桿菌(PseudomonasaeruginosaATCC 27853)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC 10231)和嗜酸乳桿菌(LactobacillusacidophilusATCC 4356)，中科院微生物研究所；人牙齦纖維原細(xì)胞系(Human gingival fibroblasts，HGF)，上海麥莎生物科技有限公司；抗菌肽Cecropin,Sigma公司。

MHB、SB、MRS培養(yǎng)基，中國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)技術(shù)研究所；MEM培養(yǎng)基：L-谷氨酰胺，10％胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 μg·mL-1鏈霉素。

Fmoc-氨基酸、2-(1H-苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、N，N′-二異丙基乙胺(DIEA)、Fmoc-His(Trt)-Wang樹脂，上海吉爾生化公司；N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二氯甲烷(DCM)、哌啶(PIPE)、三氟乙酸(TFA)，均為國(guó)產(chǎn)分析純；乙腈(ACN)，色譜純，F(xiàn)isher公司。

旋轉(zhuǎn)混合儀；Bio-Spin空柱；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)，美國(guó)Linear Scientific公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotex公司。

1.2 血管活性腸肽的合成

1.2.1 樹脂的溶脹

稱取2 g Fmoc-His(Trt)-Wang樹脂，加入NMP 20 mL，溶脹樹脂2 h。加入20 mL DCM，混勻1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。加入20 mL 20％ PIPE，反應(yīng)30 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)1次。加入20 mL DCM，混勻1 min，清空反應(yīng)器，再加入20 mL NMP，混勻 1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。

1.2.2 肽鏈的合成

向溶脹好的樹脂中加入1 g Fmoc-His-OH、1 g HBTU(用5 mL NMP溶解)、3 mol·L-1的DIEA溶液40 μL，混勻后加入到反應(yīng)器中，再加入15 mLNMP反應(yīng)2 h。清空反應(yīng)器，加入20 mL DCM，混勻1 min，清空反應(yīng)器，再加入20 mL NMP，混勻1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。加入20 mL 20％ PIPE，反應(yīng)30 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)1次。加入DCM 20 mL，混勻1 min，清空反應(yīng)器，重復(fù)2次。

采用相同的操作步驟，依次縮合Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(Bzl)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(Boc)-OH、Fmoc-Thr(Bzl)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、Fmoc-IIe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH。

1.2.3 切肽

在最后形成的多肽樹脂中，加入切割液TFA，反應(yīng)4 h，用砂芯漏斗過(guò)濾，收集濾液，用冰乙醚離心沉淀，凍干，即得VIP。

1.3 高效液相色譜分離和質(zhì)譜測(cè)定

用高效液相色譜儀進(jìn)行粗肽的分離。色譜柱為C18柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。洗脫液 A：0.05％ TFA+2％ ACN；B：0.05％ TFA+90％ ACN。線性梯度由0％ B溶液→30％ B溶液，時(shí)間30 min，流速1.0 mL·min-1。對(duì)收集的主峰進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 體外抗菌活性測(cè)定

采用瓊脂糖彌散抗菌實(shí)驗(yàn)[9]檢測(cè)VIP對(duì)各種病原菌的抗菌活性，以100 μg·mL-1抗菌肽Cecropin作為陽(yáng)性對(duì)照。

取實(shí)驗(yàn)用病原菌于50 mL相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，E.coli、S.aureus、S.mutans、E.faecalis、P.aeruginosa用MHB培養(yǎng)基，C.albicans用SB培養(yǎng)基，L.acidophilus用MRS培養(yǎng)基。接種50 μL過(guò)夜培養(yǎng)基于50 mL合適的新鮮肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 h，獲得對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的病原菌。病原菌于4 ℃、1000×g離心10 min后，用10 mmol·L-1PBS(pH值7.4)漂洗，懸浮在10 mL的PBS中。制備襯底凝膠，其中含有1％的瓊脂、5×106個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。通過(guò)渦旋分散微生物，倒入培養(yǎng)皿中。凝固后用打孔器在瓊脂上打孔洞(直徑2.5 mm)，然后向每個(gè)孔加入3 μL的VIP溶液(濃度范圍50～500 μg·mL-1)，陰性對(duì)照孔用無(wú)菌水代替。將培養(yǎng)皿置于37 ℃、好氧條件下培養(yǎng)3 h，使肽擴(kuò)散。然后將10 mL 1％的瓊脂上層凝膠(含有細(xì)菌特定培養(yǎng)基)倒入上述培養(yǎng)皿以提供病原菌生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)，于37 ℃培養(yǎng)18 h，用考馬斯亮藍(lán)G-250稀釋液染色。

用放大鏡(放大8倍)觀察抑菌圈，抑菌圈的直徑以單位U表示(1 U=0.1 mm)，需減去中心孔的直徑。

抗菌活性以最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)表示，而MIC值以x軸截距(由自由彌散單位與log10×肽的濃度的關(guān)系曲線得到)來(lái)確定。當(dāng)MIC>500 μg·mL-1時(shí)被定義為耐藥性，MIC取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)分析平均值。

1.5 對(duì)人正常細(xì)胞活性的影響

通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)VIP對(duì)人正常細(xì)胞的毒性。

將HGF接種于96孔培養(yǎng)板，加入MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。加入100 μL 100 μg·mL-1的VIP培養(yǎng)3 h，VIP未處理孔為空白對(duì)照組。吸棄培養(yǎng)液，迅速加入 10 μL 5 mg·mL-1的四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，37 ℃培養(yǎng)2 h，取出培養(yǎng)板，小心吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，于37 ℃培養(yǎng) 10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞在570 nm處的吸光度(A)值。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率：

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜分析(圖1)

圖1 血管活性腸肽的HPLC圖譜

從圖1可知，主峰面積較大，其它峰面積與主峰面積相比較小，表明合成的VIP雜質(zhì)少、純度高。根據(jù)HPLC譜圖中峰面積計(jì)算，VIP純度達(dá)到95.2％。

2.2 質(zhì)譜鑒定(圖2)

圖2 血管活性腸肽的質(zhì)譜圖

從圖2可知，實(shí)際合成的VIP相對(duì)分子質(zhì)量為3326.5，與VIP的理論分子質(zhì)量3326.5一致。圖2中主峰明顯，說(shuō)明合成的VIP經(jīng)色譜儀純化后，可以除去大部分的雜質(zhì)，得到較純的VIP。

2.3 體外抗菌活性分析

固相合成的VIP對(duì)幾種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的體外抑制作用見表1。

表1 血管活性腸肽對(duì)不同受試菌的最小抑菌濃度/μg·mL-1

由表1可知，VIP對(duì)病原微生物E.coli、P.aeruginosa、C.albicans和S.mutans表現(xiàn)出不同程度的抗菌活性，其中對(duì)E.coli、P.aeruginosa的抑制效果較明顯。陽(yáng)性對(duì)照組(100 μg·mL-1Cecropin)能有效地抑制各種受試微生物(E.faecalis除外)，而陰性對(duì)照組(無(wú)菌水)無(wú)抗菌活性。

2.4 血管活性腸肽對(duì)細(xì)胞存活率的影響(圖3)

圖3 血管活性腸肽對(duì)人牙齦纖維原細(xì)胞存活率的影響

由圖3可知，VIP對(duì)人正常細(xì)胞系HGF的活性無(wú)影響，在作用濃度為100 μg·mL-1時(shí)，HGF細(xì)胞的存活率為93％。

2.5 討論

本研究采用FMOC固相方法合成VIP，粗肽經(jīng)過(guò)純化和分離得到預(yù)期活性產(chǎn)物。選用Fmoc-His(Trt)-Wang樹脂為合成的起點(diǎn)，將VIP羧端固定在樹脂上，向氨基端逐步遞加、延長(zhǎng)肽鏈，每一步反應(yīng)均較易進(jìn)行，消旋化的可能性小，但要求每步反應(yīng)都達(dá)到高產(chǎn)率。目標(biāo)肽的粗品經(jīng)高效液相色譜分析純度為95.2％，質(zhì)譜分析其相對(duì)分子質(zhì)量為3326.5，與理論值一致。由于多肽是用固相法合成的，氨基酸的連接順序固定，證明了合成的VIP結(jié)構(gòu)正確。

神經(jīng)肽在神經(jīng)性炎癥和疼痛方面起重要作用，還參與免疫調(diào)節(jié)[10]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，神經(jīng)肽通過(guò)直接的抗菌作用在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用[6]。已有報(bào)道神經(jīng)肽對(duì)來(lái)自皮膚、口腔、呼吸道和胃腸道的一系列微生物都有抗菌活性。作者首次報(bào)道固相合成的VIP對(duì)病原菌E.coli和P.aeruginosa具有較強(qiáng)的抗菌作用。在口腔組織中，神經(jīng)肽在調(diào)節(jié)神經(jīng)性炎癥中發(fā)揮著重要的作用。對(duì)于細(xì)菌引起的炎癥狀態(tài)如牙髓炎和牙周炎，常?？捎^察到神經(jīng)肽表達(dá)量的上調(diào)[3～5]。神經(jīng)肽在齲齒附近牙髓的成牙質(zhì)細(xì)胞層和成牙質(zhì)細(xì)胞下層的萌芽[5]，導(dǎo)致炎癥部位神經(jīng)肽水平的提高，從而發(fā)揮直接的抗菌作用。研究還表明，即使在濃度為100 μg·mL-1時(shí)，在瓊脂糖彌散抗菌實(shí)驗(yàn)中具有抗菌活性的VIP對(duì)人正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性仍有限，支持其在選擇性地殺傷細(xì)菌方面的生理作用。

一些種屬的細(xì)菌如L.acidophilus、E.faecalis和S.aureus對(duì)VIP的抗菌效應(yīng)表現(xiàn)出耐受性。目前這些耐受性還不能解釋清楚，但是S.mutans顛覆陽(yáng)離子抗菌肽的能力被認(rèn)為是細(xì)胞表面靜電作用的改變使得其凈負(fù)電荷減少，導(dǎo)致其和陽(yáng)離子抗菌肽結(jié)合力的降低[11]。

神經(jīng)肽和抗菌肽在分子大小、氨基酸組成、兩親性設(shè)計(jì)和陽(yáng)離子電荷方面的相似性支持了神經(jīng)肽能作為抗感染分子的假說(shuō)[6]。研究表明，VIP對(duì)E.coli和P.aeruginosa的抗菌活性可以與已經(jīng)報(bào)道的抗菌肽α-防御素相比[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中神經(jīng)肽的體外抗菌活性譜也表明其調(diào)節(jié)內(nèi)在免疫應(yīng)答的潛力。由于抗菌肽體內(nèi)活性受到pH值、離子濃度、與蛋白質(zhì)和糖胺聚糖的結(jié)合力等因素以及[13]體內(nèi)生理性相互作用的影響，有必要進(jìn)一步深入研究。神經(jīng)肽可能的相互協(xié)同作用及其對(duì)臨床分離菌株的活性作用的研究將有助于開發(fā)其作為新的治療劑的潛力。

3 結(jié)論

采用Na-芴甲氧羰基(FMOC)作為α-氨基的保護(hù)基，以逐個(gè)延伸的固相合成法合成了血管活性腸肽，以最小抑菌濃度(MIC)評(píng)價(jià)其體外抗菌活性。高效液相色譜和質(zhì)譜分析表明所合成的血管活性腸肽的純度為95.2％，相對(duì)分子質(zhì)量為3326.5；血管活性腸肽對(duì)幾種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有不同程度的抑制活性，其中對(duì)E.coli和P.aeruginosa的抑制效果最好。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yeung A T Y，Gellatly S L，Hancock R E W.Multifunctional cational host defence peptides and their clinical applications[J].Cell Mol Life Sci，2011,68(13):2161-2176.

[2]Lundy F T，Linden G J.Neuropeptides and neurogenic mechani-sms in oral and periodontal inflammation[J].Crit Rev Oral Biol Med，2004，15(2)：82-98.

[3]Awawdeh L，Lundy F T，Shaw C，et al.Quantitative analysis of substance P，neurokinin A and calcitonin generelated peptide in pulp tissue from painful and healthy human teeth[J].Int Endod J，2002，35(1)：30-36.

[4]Linden G J，Mullally B H，Burden D J，et al.Changes in vasoactive intestinal peptide in gingival crevicular fluid in response to periodontal treatment[J].J Clin Periodontol，2002，29(6):484-489.

[5]EI Karim I A，Lamey P J，Ardill J，et al.Vasoactive intestinal polypeptide(VIP) and VPAC1 receptor in adult human dental pulp in relation to caries[J].Arch Oral Biol，2006，51(10):849-855.

[6]Brogden K A，Guthmiller J M，Zasloff M.The nervous system and innate immunity：The neuropeptide connection[J].Nat Immunol，2005，6(6)：558-564.

[7]Allaker R P，Grosvenor P W，McAnemey D C，et al.Mechanisms of adrenomedullin antimicrobial action[J].Peptides，2006，27(4):661-666.

[8]Chorny A，Gonzalez-Rey E，Varela N，et al.Signaling mechanisms of vasoactive intestinal peptide in inflammatory conditions[J].Regul Pept，2006，137(1):67-74.

[9]Hokfelt T，Bartfai T，Bloom F.Neuropeptides：Opportunities for drug discovery[J].Lancet Neurol,2003，2(8)：463-472.

[10]Bost K L.Tachykinin-mediated modulation of the immune res-ponse[J].Front Biosci，2004，9(S)：3331-3332.

[11]Peschel A，Otto M，Jack R W，et al.Inactivation of the dlt operon inStaphylococcusaureusconfers sensitity of defensins，protegrins，and other antimicrobial peptides[J].J Biol Chem,1999,274(13):8405-8410.

[12]Lundy F T，Nelson J，Lockhart D，et al.Antimicrobial activity of truncated alpha-defensin(human neutrophil peptide(HNP)-1) analogues without disulphide bridges[J].Mol Immunol，2008，45(1)：190-193.

[13]Baranska-Rybak W，Sonesson A，Nowicki R，et al.Glycosaminoglycans inhibit the antibacterial activity of LL-37 in biological fluids[J].J Antimicrob Chemother，2006，57(2)：260-265.