阿魏酸雙芐酯的合成及生物活性研究

孟繁龍，李 碩，張慶一，張宇超，楊云彩，孫學(xué)軍

(曲阜師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院 山東省生命有機(jī)分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 曲阜 273165)

阿魏酸，化學(xué)名為4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸，是植物界普遍存在的一種酚酸，也是當(dāng)歸、川芎、阿魏等中藥的有效成分之一[1]，作為國(guó)際公認(rèn)的天然抗氧化劑和防癌物質(zhì)引起世人關(guān)注[2]。研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板凝集和血栓、清除亞硝酸鹽和氧自由基、抗菌消炎、抗腫瘤、抗突變和增強(qiáng)免疫力等功能[3]。目前，一些國(guó)家已批準(zhǔn)阿魏酸用于食品、化妝品及藥品[4]。

阿魏酸分子中的烷烴較短且含有雙鍵，親水性較強(qiáng)，難以深入生物膜脂質(zhì)雙分子層中發(fā)揮其藥理作用[5]。研究表明，阿魏酸衍生物比阿魏酸具有更強(qiáng)的藥理活性和較低的毒性[6]。目前，已成功合成了阿魏酸酯類衍生物、阿魏酸酰胺類衍生物、阿魏酸醚類衍生物、阿魏酸酮類衍生物、芳環(huán)有取代基的阿魏酸衍生物[5]，其中以阿魏酸鈉鹽、阿魏酸哌嗪、阿魏酸的高分子載體衍生物等為代表的部分化合物已經(jīng)用于臨床或具有臨床應(yīng)用的潛力[7]。然而，有關(guān)阿魏酸雙芐酯的合成、抑菌活性及與DNA相互作用的研究報(bào)道仍不多見(jiàn)[8～15]。

作者在此以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，以阿魏酸與氯化芐在堿性條件下反應(yīng)，成功合成了阿魏酸雙芐酯，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并研究了其生物活性。擬為進(jìn)一步研究阿魏酸雙芐酯及其水解產(chǎn)物的抑菌活性和抗癌作用提供參考。反應(yīng)方程式為：

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑、材料與儀器

阿魏酸(純度>98.5%)，曲阜弘利化工有限公司；大腸桿菌，山東省衛(wèi)生防疫站；小牛胸腺DNA(ct-DNA，A260/A280>1.8，未做提純處理)、吖啶橙(Acridine orange，AO)，Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris，分析純)，上海展云化工有限公司；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

牛肉浸膏液體培養(yǎng)基：取200 mL水、2 g蛋白胨、1 g牛肉浸膏、1 g氯化鈉，加熱煮沸，冷卻至室溫后，調(diào)pH值至7.2～7.4，121 ℃蒸汽滅菌30 min，冷卻至室溫后，置于冰箱中備用。

WRS-1A型數(shù)字熔點(diǎn)儀，上海精賢光電科技有限公司；655A型高效液相色譜儀、F-4600型熒光分光光度計(jì)，日本日立；CARY300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)瓦里安；NEXUS-470型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet；AVANCE 300型核磁共振儀，德國(guó)Bruker公司；7.0T型傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀，美國(guó)IonSpec；SMART APEX CCD型X-射線單晶衍射儀，美國(guó)Bruker AXS Inc；3114/3236 TAM Air型八通道微量熱活性檢測(cè)儀，瑞典Thermal Metric AB公司；烏貝路德粘度計(jì)，上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 阿魏酸雙芐酯的合成

將0.01 mol阿魏酸、0.025 mol NaHCO3和15 mL DMSO加入到帶有攪拌的三頸燒瓶中，加熱溶解后滴入0.022 mol氯化芐和5 mL DMSO的混合溶液，控溫110～120 ℃,控制pH=8～9，反應(yīng)1.5 h，用TLC檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)程[展開劑為V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶3的混合溶液]。反應(yīng)完成后稍加冷卻，倒入100 mL冰水中，即有白色固體析出。靜置，抽濾，濾餅用25 mL無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得到白色針狀晶體，即阿魏酸雙芐酯，產(chǎn)率為94.32%。

1.3 大腸桿菌抑菌活性實(shí)驗(yàn)

用微量量熱法測(cè)定不同濃度的阿魏酸雙芐酯溶液對(duì)大腸桿菌代謝作用的熱功率-時(shí)間曲線。

(1)用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)準(zhǔn)確配制濃度為0.25 mg·mL-1的阿魏酸雙芐酯溶液，置于冰箱中備用。

(2)在紫外燈下，用酒精燈灼燒過(guò)的取菌器轉(zhuǎn)移大腸桿菌到牛肉浸膏液體培養(yǎng)基中，反復(fù)3次，在恒溫下密封培養(yǎng)。

(3)將安瓶放在滅菌臺(tái)上消毒15 min，然后裝入培養(yǎng)基并接菌，移入一定量的阿魏酸雙芐酯溶液，封口，放入基線穩(wěn)定且溫度恒定在37 ℃的微量熱活性檢測(cè)儀中，開始記錄數(shù)據(jù)，當(dāng)細(xì)菌代謝的熱功率—時(shí)間曲線返回到基線時(shí)即可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 與DNA相互作用的研究

1.4.1 試劑的配制

ct-DNA：配成濃度為2.3×10-4mol·L-1的水溶液，其濃度據(jù)260 nm處的吸光度確定(按ε=6600 L·mol-1·cm-1)，置于冰箱中備用。

吖啶橙：配成濃度為1×10-4mol·L-1的水溶液，置于冰箱中備用。

三羥甲基氨基甲烷：用其配制Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液，內(nèi)含0.1 mol·L-1NaCl。

阿魏酸雙芐酯：用無(wú)水乙醇配成濃度(用[D]表示)為1×10-3mol·L-1的溶液，避光保存。

1.4.2 與DNA相互作用的紫外光譜測(cè)定

在1 cm比色皿中加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.2 mL阿魏酸雙芐酯溶液，搖勻，用ct-DNA溶液進(jìn)行滴定，掃描紫外吸收光譜，每次進(jìn)樣50 μL。

1.4.3 與DNA相互作用的熒光光譜測(cè)定

在1 cm比色皿中加入2 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.1 mL吖啶橙溶液、0.3 mL ct-DNA溶液，搖勻，放置5 min，用阿魏酸雙芐酯溶液滴定，掃描熒光光譜，每次進(jìn)樣20 μL。熒光條件為：激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，λex=480 nm，電壓700 V，掃描速率1200 nm·s-1。

1.4.4 粘度測(cè)定

固定ct-DNA濃度，改變阿魏酸雙芐酯濃度，以Tris-HCl緩沖溶液配制溶液，在25 ℃恒溫水浴槽中用烏氏粘度計(jì)測(cè)定其粘度。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)品表征

產(chǎn)品為白色針狀晶體，熔點(diǎn)為86～87 ℃，高效液相色譜儀測(cè)得純度為98.5%。

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)為204 nm、236 nm、325 nm。

IR(KBr)，ν：3133 cm-1處為苯環(huán)C-H伸縮振動(dòng)特征吸收峰，1510 cm-1處為苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)特征吸收峰，1696 cm-1處為羰基伸縮振動(dòng)特征吸收峰，1400 cm-1處為CH2中C-H變形振動(dòng)特征吸收峰，1247 cm-1處為芳醚中C-O-C伸縮振動(dòng)特征吸收峰，999 cm-1處為E型碳碳雙鍵中C-H變形振動(dòng)特征吸收峰。

1HNMR(CDCl3)，δ，ppm：3.90(s，3H，CH3)，5.18(s，2H，CH2)，5.24(s，2H，CH2)，6.35(m，1H，C=CH)，6.86(m，1H，C=CH)，7.01～7.68(m，13H，3C6H6)。

質(zhì)譜儀測(cè)得其相對(duì)分子質(zhì)量為374.4291 g·mol-1。

X-射線單晶衍射儀測(cè)得其分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 阿魏酸雙芐酯的分子結(jié)構(gòu)

綜合分析，確定合成產(chǎn)物為阿魏酸雙芐酯。

2.2 對(duì)大腸桿菌的抑菌活性

根據(jù)大腸桿菌在一定濃度的阿魏酸雙芐酯溶液中代謝作用的熱功率-時(shí)間曲線數(shù)據(jù)，用Logistic方程處理細(xì)菌的指數(shù)生長(zhǎng)期，計(jì)算出該濃度下的細(xì)菌生長(zhǎng)速率常數(shù)μ[16]。大腸桿菌在不同濃度的阿魏酸雙芐酯溶液中的生長(zhǎng)速率常數(shù)見(jiàn)表1。

表1 大腸桿菌在不同濃度的阿魏酸雙芐酯溶液中的生長(zhǎng)速率常數(shù)

以生長(zhǎng)速率常數(shù)μ對(duì)濃度c作圖，所得μ-c曲線見(jiàn)圖2。擬合線性回歸方程為：μ=0.08793-0.00295c。

圖2 阿魏酸雙芐酯對(duì)大腸桿菌抑菌活性的μ-c曲線

μ=0 min-1時(shí)所對(duì)應(yīng)的c值，即為阿魏酸雙芐酯對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)。

測(cè)得37 ℃下阿魏酸雙芐酯對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為29.81 μg·mL-1，說(shuō)明阿魏酸雙芐酯對(duì)大腸桿菌具有一定的抑制作用。

王利萍[11]研究表明，以阿魏酸乙酯為代表的阿魏酸鏈狀酯對(duì)大腸桿菌沒(méi)有抑菌活性；梁盛年等[12]、張春樂(lè)等[13]研究表明，只有肉桂酸和少數(shù)肉桂酸衍生物對(duì)大腸桿菌有抑制作用，例如：肉桂酸和對(duì)羥基肉桂酸對(duì)大腸桿菌有一定的抑菌活性，其MIC值分別為1 mg·mL-1和0.75 mg·mL-1。該值遠(yuǎn)大于阿魏酸雙芐酯對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度，說(shuō)明后者對(duì)大腸桿菌有更好的抑制作用。這為進(jìn)一步研究阿魏酸雙芐酯及其水解產(chǎn)物的抑菌活性提供了參考。

2.3 與DNA的相互作用

2.3.1 紫外光譜分析

在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，阿魏酸雙芐酯與ct-DNA系列溶液的紫外吸收光譜見(jiàn)圖3。

[D]=1×10-3 mol·L-1；[ct-DNA]=2.3×10-4 mol·L-1；ct-DNA用量(μL)，1～13：0，50，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600

由圖3可以看出，ct-DNA使阿魏酸雙芐酯原本在236 nm、325 nm兩處的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，對(duì)前者的吸收具有明顯的增色效應(yīng)，對(duì)后者的吸收具有一定的減色效應(yīng)，并且在295 nm附近形成一個(gè)等色吸收點(diǎn)，這說(shuō)明阿魏酸雙芐酯與ct-DNA發(fā)生了相互作用。Long等認(rèn)為，當(dāng)小分子與DNA發(fā)生嵌插作用時(shí)，小分子的π軌道和DNA堿基π軌道相互耦合，最大吸收峰發(fā)生紅移或藍(lán)移，且存在減色或增色效應(yīng)；當(dāng)小分子與DNA發(fā)生靜電作用時(shí)，峰位置不變，只有強(qiáng)度改變[15]。據(jù)此初步判斷阿魏酸雙芐酯是以經(jīng)典插入方式與ct-DNA鍵合的。

2.3.2 熒光光譜分析

吖啶橙(AO) 可以插入到DNA雙鏈的堿基對(duì)之間，因此AO-DNA復(fù)合物中AO的熒光強(qiáng)度比游離AO的熒光強(qiáng)度強(qiáng)得多。然而當(dāng)其它也能與DNA發(fā)生插入作用的化合物存在時(shí)，會(huì)將AO從AO-DNA復(fù)合物中擠出，使得熒光強(qiáng)度降低發(fā)生熒光猝滅，因此AO可作為化合物與DNA作用模式的結(jié)構(gòu)探針[17]。

固定AO、ct-DNA濃度，考察阿魏酸雙芐酯濃度對(duì)AO-DNA體系熒光光譜的影響，結(jié)果如圖4所示。

[ct-DNA]=2.3×10-4mol·L-1；[AO]=1×10-4mol·L-1；[D]=1×10-3mol·L-1；阿魏酸雙芐酯用量(μL)，1～11：0，20，40，60，80，100，120，140，160，180，200

由圖4可以看出，AO-DNA熒光特征峰的強(qiáng)度隨阿魏酸雙芐酯用量(即濃度)的增加而下降，說(shuō)明阿魏酸雙芐酯對(duì)AO-DNA的熒光具有猝滅作用。這可能是阿魏酸雙芐酯同AO競(jìng)爭(zhēng)與DNA的結(jié)合位點(diǎn)，將AO從雙螺旋中擠出，從而減弱了AO-DNA體系的熒光強(qiáng)度。

熒光猝滅作用因猝滅機(jī)制不同分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用，其作用過(guò)程遵循Stern-Volmer方程[18]：

F0/F=1+Kqτ0[D]=1+KSV[D]

式中：F0和F為未加入和加入阿魏酸雙芐酯時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)；τ0為沒(méi)有阿魏酸雙芐酯存在下熒光分子的平均壽命，約10-8s；KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

以阿魏酸雙芐酯最大發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處的熒光強(qiáng)度按Stern-Volmer方程作線性回歸，得到阿魏酸雙芐酯對(duì)ct-DNA的Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV為3.26×103L·mol-1，進(jìn)一步求得其雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)Kq為3.26×1011L·mol-1·s-1，遠(yuǎn)大于猝滅劑對(duì)生物大分子最大擴(kuò)散控制的碰撞猝滅常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，由此確定阿魏酸雙芐酯對(duì)ct-DNA的猝滅并非分子間動(dòng)態(tài)碰撞所致，而是由于形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅。

靜態(tài)猝滅可用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程進(jìn)行描述[19]，即：

式中：KD為阿魏酸雙芐酯與ct-DNA的結(jié)合常數(shù)。

圖5 阿魏酸雙芐酯對(duì)AO-DNA體系作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

由圖5中直線的斜率求得阿魏酸雙芐酯與ct-DNA的結(jié)合常數(shù)KD=1.58×103L·mol-1。

2.3.3 粘度測(cè)定分析

在缺乏晶體數(shù)據(jù)的情況下，粘度測(cè)定被認(rèn)為是確定鍵合模式最可靠的方法之一。配合物以部分插入的方式與DNA結(jié)合時(shí)，DNA溶液的粘度隨配合物含量的增加而減?。灰造o電或溝面方式結(jié)合時(shí)，DNA溶液的粘度變化不大；而通過(guò)經(jīng)典插入方式與DNA作用時(shí)，DNA溶液的粘度隨配合物含量的增加而增大[20]。

25 ℃下，阿魏酸雙芐酯用量對(duì)ct-DNA相對(duì)比粘度的影響見(jiàn)圖6。

圖6 阿魏酸雙芐酯用量對(duì)ct-DNA相對(duì)比粘度的影響

由圖6可以看出，隨著ct-DNA中阿魏酸雙芐酯濃度的增大，其相對(duì)比粘度逐漸增大，由此可進(jìn)一步判斷阿魏酸雙芐酯與DNA的作用方式為經(jīng)典插入方式。

項(xiàng)朋志等[14]用電化學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸與DNA的相互作用以嵌插作用為主，結(jié)合常數(shù)為1.01×104L·mol-1。于婷婷等[15]用紫外光譜法研究發(fā)現(xiàn)，阿魏酸乙酯與DNA結(jié)合生成了一種非電活性的超分子化合物，結(jié)合常數(shù)為6.0×106L·mol-1。而本研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸雙芐酯與ct-DNA的作用方式為經(jīng)典插入方式，結(jié)合常數(shù)為1.58×103L·mol-1。由此表明，阿魏酸及其不同衍生物與DNA的作用方式和結(jié)合強(qiáng)度差別較大。

3 結(jié)論

以DMSO為溶劑，以阿魏酸與氯化芐在堿性條件下反應(yīng)合成了阿魏酸雙芐酯，產(chǎn)率為94.32%，純度為98.5%。通過(guò)紫外光譜、紅外光譜、核磁共振氫譜、質(zhì)譜及X-單晶衍射對(duì)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。用微量量熱法測(cè)得阿魏酸雙芐酯對(duì)大腸桿菌的MIC值為29.81 μg·mL-1，說(shuō)明阿魏酸雙芐酯對(duì)大腸桿菌具有一定的抑制作用。通過(guò)紫外光譜、熒光光譜和粘度測(cè)定證實(shí)阿魏酸雙芐酯與ct-DNA之間存在相互作用，其作用方式為經(jīng)典插入方式，對(duì)ct-DNA的猝滅是由于形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅，與ct-DNA的結(jié)合常數(shù)為1.58×103L·mol-1。為進(jìn)一步研究阿魏酸雙芐酯及其水解產(chǎn)物的抑菌活性和抗癌作用提供了具有參考價(jià)值的信息。

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