HPLC法測定腎石通顆粒中槲皮素的含量

羅愛勤 陳澤鋒

（廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司，廣東 廣州 510240）

HPLC法測定腎石通顆粒中槲皮素的含量

羅愛勤 陳澤鋒

（廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司，廣東 廣州 510240）

目的：建立高效液相色譜法測定腎石通顆粒中槲皮素含量的方法。方法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(200mm×4.6mm)，柱溫30℃，流動相為甲醇-水(50∶50)，流速1.0mL/min，檢測波長360 nm。結(jié)果：槲皮素在0.090 4～0.904 0 μg范圍內(nèi)質(zhì)量與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系，平均回收率98.8%，RSD=1.71%。結(jié)論：該法靈敏、準(zhǔn)確，可作為腎石通顆粒的質(zhì)量控制方法。

高效液相色譜法；腎石通顆粒；槲皮素；含量測定

腎石通顆粒是由金錢草、王不留行（炒）、萹蓄、瞿麥、海金沙、丹參、雞內(nèi)金（燙）、延胡索（醋制）、牛膝、木香等 10味中藥制成，具有清熱利濕、活血止痛、化石、排石的功效，用于腎結(jié)石、腎盂結(jié)石、膀胱結(jié)石、輸尿管結(jié)石。收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中藥成方制劑第二冊）。該標(biāo)準(zhǔn)中只有性狀、顆粒劑檢查項，尚未建立含量測定項。金錢草和萹蓄為方中主藥，均含有槲皮素，高效液相色譜法（HPLC）測定槲皮素的含量已有文獻(xiàn)[1-5]報道。本研究依照上述文獻(xiàn)開展實驗，結(jié)果證明用磷酸溶液的流動相pH值很小，約為2[6]，供試品溶液含鹽酸pH值也約為2，長時間運行后，容易損耗色譜柱和高效液相設(shè)備。因此，在已有文獻(xiàn)報道HPLC法的基礎(chǔ)上，對色譜條件和供試品溶液的制備方法加以改進(jìn)，建立了HPLC測定腎石通顆粒中槲皮素含量的方法。該法靈敏、快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可有效控制該制劑質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀；依利特十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 試藥

腎石通顆粒及陰性樣品 （廣州漢方現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司）；槲皮素對照品（原中國藥品生物制品檢定所，批號為100081-200406），甲醇（色譜純），水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

2.1 色譜條件

依利特十八烷基鍵合硅膠色譜柱 (200 mm× 4.6 mm，5 μm)，柱溫30℃，流動相甲醇-水（50∶50），流速1.0 mL/min，檢測波長360 nm。理論板數(shù)按槲皮素峰計算不低于2 000。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗

分別精密吸取槲皮素對照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測定，色譜圖見圖1。槲皮素的保留時間約為19 min，與其他組分分離良好（分離度大于1.5）陰性溶液色譜圖在槲皮素峰位置無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A對照品 B供試品C缺金錢草、萹蓄陰性溶液

3 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含槲皮素0.05 mg的溶液，即得。

4 供試品溶液的制備

取本品約20 g，研細(xì)，精密稱定，加水100 mL，加熱回流1.5 h，離心，濃縮至10 mL，加乙醇40 mL，攪拌，靜置30 min，濾過，濾液蒸干，用水20 mL使溶解，加鹽酸 4 mL，加熱回流水解1 h后，放冷，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次24 mL，合并乙酸乙酯提取液，用水洗滌3次，每次70 mL，乙酸乙酯液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

5 陰性溶液的制備

取缺金錢草、萹蓄的陰性樣品，按4項下方法制備，即得。

6 方法學(xué)考察

6.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取含量為0.045 2 mg/mL槲皮素對照品溶液2、4、6、8、10和20 μL進(jìn)樣。以峰面積A（mAU*s）對槲皮素峰的質(zhì)量數(shù)C（μg）回歸，結(jié)果見表1和圖2。

表1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程

相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。

以上結(jié)果表明槲皮素在0.090 4～0.904 0 μg范圍內(nèi)，與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

6.2 精密度試驗

精密吸取槲皮素對照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積分別為：543.8587、532.9718、544.747 3、539.142 7、541.521 1、543.615 5，得平均峰面積值為540.976 2，計算RSD=0.82%，表明本測定法精密度良好。

6.3 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別在 0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣10 μL測定，以峰面積計算得槲皮素的峰面積RSD分別為0.63%（n=6），表明供試品溶液中槲皮素在 8 h內(nèi)穩(wěn)定[7-9]。

6.4 重復(fù)性試驗

取同批供試品（110701-1）6份，研細(xì)，精密稱定，按4項下方法制備，進(jìn)樣10 μL測定，測得槲皮素0.006 mg/g，RSD為2.25%（n=6），表明本法具有良好的重復(fù)性。

6.5 準(zhǔn)確度試驗

采用加樣回收法，取已知含量樣品(110701-1)，研細(xì)，精密稱取6份，每份10 g，分別置6只具塞錐形瓶中，精密加入含槲皮素對照品0.06 mg/mL的對照品溶液 1 mL，按 4項下方法制備，進(jìn)樣10 μL測定，測得槲皮素回收率98.80%，RSD= 1.71%（n=60）。

7 樣品測定

取3批樣品 (110701-1、110821、110822)及另外5個廠家市售的腎石通含糖顆粒，按4項下方法制備，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定樣品中槲皮素的含量，結(jié)果見表2。

表2 腎石通顆粒槲皮素含量

8 討論

本測定法中的流動相，用水替代了磷酸溶液，結(jié)果表明加磷酸對槲皮素的峰形和保留時間影響不大，因此，本研究把流動相設(shè)為甲醇-水[10]混合溶液。另外還比較了不設(shè)柱溫和柱溫設(shè)為30℃[11]槲皮素峰的保留時間，發(fā)現(xiàn)柱溫設(shè)為30℃時，槲皮素在12 h內(nèi)保留時間穩(wěn)定，而不設(shè)柱溫，槲皮素保留時間不穩(wěn)定。

槲皮素在冷水中幾乎不溶，由于顯弱酸性，在冷的酸水中的溶解度很小。槲皮素能溶于乙酸乙酯和正丁醇等與水不相溶的溶劑，因此，在研究供試品溶液制備方法過程中，用乙酸乙酯提取槲皮素，用水飽和正丁醇提取剩余溶液以檢驗乙酸乙酯的提取是否完全。結(jié)果顯示用乙酸乙酯提取3次后，乙酸乙酯層溶液接近無色，接著用水飽和正丁醇提取不出槲皮素，說明乙酸乙酯已經(jīng)提取完全。用蒸餾水洗滌乙酸乙酯溶液，洗滌至3次即能達(dá)到中性，且槲皮素?zé)o損失。

此外，本研究還對供試品溶液的提取方法(加熱回流、超聲、微波提取[12]等)，提取溶劑(水、甲醇、65%乙醇、乙醇等)，溶劑的量，提取時間，水解前加水量，加酸量和水解時間等進(jìn)行了考察，從而得出供試品溶液制備方法，該法其他成分干擾少，分離度令人滿意。

本研究建立的HPLC測定槲皮素含量的方法穩(wěn)定性、重復(fù)性好，精密度、回收率都較滿意，能有效控制腎石通顆粒的質(zhì)量。

[1] 吳戌，秦英，石寧.高效液相色譜法測定腎石通顆粒中槲皮素的含量[J].中國新醫(yī)藥，2003，2（10）:30-32.

[2] 何勇.高效液相色譜法測定腎石通顆粒中槲皮素的含量[J].安徽醫(yī)藥，2006，10（2）:119-120.

[3] 肖峰，張敏.HPLC法測定腎石通顆粒中槲皮素含量[J].安徽醫(yī)藥，2009，13（1）:34-36.

[4] 王義恩.高效液相色譜法測定腎石通顆粒中槲皮素與山柰素含量[J].中國藥業(yè)，2010，19（7）:27-28.

[5] 雷愛海，杜洪濤，李艷林，等.腎石通顆粒質(zhì)量控制方法研究[J].大理學(xué)院學(xué)報，2010，9（8）:6-9.

[6] 文才華，涂文升.HPLC法測定腎石通顆粒中延胡索乙素含量[J].中國醫(yī)藥指南，2010，8（34）:230-231.

[7] 董翠萍.HPLC法測定腎石通顆粒中原兒茶醛的含量[J].齊魯藥事，2011，30（9）:505-506.

[8] 巴小翠，李強.腎石通顆粒中丹酚酸B含量測定研究[J].中國科技信息，2011（14）:169，175.

[9] 張俊燕.腎石通顆粒中丹酚酸B的含量測定方法研究[J].齊魯藥事，2011，30（6）:329-330.

[10] 趙煥君，趙琳，孫長晶，等.高效液相色譜法測定槲樹葉中槲皮素的含量[J].化學(xué)工程師，2011，25（7）:23-24.

[11] 王曉娟，侯安國，王芳菲.彝藥明目茶中槲皮素含量測定方法研究[J].云南中醫(yī)中藥雜志，2011，32（9）:66-67.

[12] 張雙靈，姜豪，于春娣.微波輔助提取荷葉中槲皮素的工藝研究[J].農(nóng)機化研究，2011，33（9）:173-175，180.

Content Determination of Quercetin in Shenshitong Granules by HPLC

Luo Aiqin，Chen Zefeng(Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co，Ltd.，Guangdong Guangzhou 510240，China)

Objective:To develop a method for the content determination of quercetin in Shenshitong Granules by HPLC.Methods:Chromatographic column(200 mm×4.6 mm)of octadecylsilane chemically bonded silica was used.The column temperature was at 30℃，the mobile phase was methanol-water(50∶50)，the flow rate was 1.0 mL/min，and the detection wavelength was at 360 nm. Results:There was a good linear relationship between the quality and peak area integral value in the range of 0.090 4～0.904 0 μg for quercetin.The average recovery rate was 98.8% (RSD=1.71%).Conclusion:The method is sensitive，accurate and can be used for quality control of Shenshitong Granules.

HPLC；Shenshitong Granules；Quercetin；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.03.005

2011-11-08）

廣東省科技計劃項目——以動態(tài)逆流提取和納濾濃縮為核心的高效節(jié)能成套技術(shù)及裝備的開發(fā)（2009A030901008）

羅愛勤，女，制藥工程師，執(zhí)業(yè)藥師。研究方向：中藥新藥和保健食品。E-mail：aiqin1114@163.com