艾葉多糖的提取、含量測定及對(duì)羥自由基清除作用的研究

譚冰嚴(yán)煥寧黃鎖義廖慧嫻張強(qiáng)

（1右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，廣西 百色533000；2右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系）

艾葉多糖的提取、含量測定及對(duì)羥自由基清除作用的研究

譚冰1嚴(yán)煥寧1黃鎖義1廖慧嫻2張強(qiáng)2

（1右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，廣西 百色533000；2右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系）

目的：探討艾葉多糖的提取、含量測定及其對(duì)羥自由基（·OH）的清除作用。方法：采用熱水浸提法提取艾葉多糖并進(jìn)行初步純化；苯酚-硫酸法測定其含量；·OH清除實(shí)驗(yàn)觀察艾葉多糖對(duì)·OH的作用。結(jié)果：樣品中多糖含量為2.56%，回收率為98.45%，RSD= 0.391%（n=5），其純度和產(chǎn)率均較高；艾葉多糖溶液對(duì)由Fenton體系產(chǎn)生的·OH有一定的清除作用，隨著艾葉多糖濃度的增加，對(duì)·OH自由基的清除能力也增強(qiáng)。結(jié)論：艾葉中含有一定量的多糖；艾葉多糖對(duì)·OH具有較好的清除作用，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。

艾葉多糖；提??；含量測定；羥自由基清除

艾葉（Artemisiae Argyi Folum）為菊科多年生草本植物艾（Artemisia argy lévl.et Vant.）的葉，全國大部分地區(qū)均產(chǎn)，具有濃烈香氣。其藥用歷史悠久最早記載于《中醫(yī)別錄》。傳統(tǒng)藥性理論認(rèn)為艾葉有理氣血、逐寒濕、溫經(jīng)血、安胎、殺蟲止癢等作用，用于虛寒出血、尤宜于崩漏[1]。近年藥理研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)艾葉有抗菌、抗病毒、平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗過敏、止血和抗凝血、增強(qiáng)免疫功能、護(hù)肝利膽、解熱鎮(zhèn)靜、抑制心臟收縮及降壓等作用。艾葉除了含有主要成分揮發(fā)油外，還含有鞣質(zhì)、黃酮、甾醇、多糖、微量元素及其他有機(jī)成分等[2]。大量的藥理和臨床研究表明，多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，它能激活免疫細(xì)胞，提高機(jī)體的免疫功能，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有毒副作用[3]，近年來對(duì)植物多糖的研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)。本研究對(duì)艾葉中活性多糖進(jìn)行提取、分離純化以及對(duì)羥自由基的清除作用等方面進(jìn)行考察，旨在為天然藥物的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 原料與試劑

95%乙醇、無水乙醇、乙醚、鹽酸、硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇、活性炭、30%雙氧水、硫酸亞鐵、1，10-菲羅啉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為分析純；雙蒸餾水；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(J＆K CHEMICAL LTD)；艾葉干品（采自廣西貴港，粉碎成粉末）。

1.2 主要儀器設(shè)備

FW100型高速萬能粉碎機(jī) （天津泰斯特儀器有限公司）；電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；DHG-9070A型電熱恒溫旋風(fēng)干燥箱（上海精密設(shè)備有限公司）；電熱式恒溫水浴鍋（江蘇金壇宏凱儀器廠）；循環(huán)水真空抽氣泵(上海嘉鵬科技有限公司)；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；78WH-1恒溫磁力攪拌器（杭州藍(lán)天化驗(yàn)儀器廠）；臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；722N型紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 艾葉多糖的提取

稱取粉碎的艾葉粉末10 g，放置燒杯中，加入約150 mL蒸餾水，將其置于電熱恒溫水浴鍋中，溫度控制在80℃左右，3 h后，用循環(huán)水式多用真空泵進(jìn)行抽濾，將濾液放入另外的500 mL大燒杯中：用同樣的方法重復(fù)提取3次，合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至10～20 mL，冷卻至室溫后，加入60 mL乙醇，在背光處靜置 24 h，抽濾，濾餅依次用乙醇和乙醚洗2次，得到灰色粉末狀固體0.812 g。

2.2 艾葉多糖粗品的提純

2.2.1 活性炭脫色 將多糖粗品置于燒杯中，一定量蒸餾水溶解，加入適量活性炭，于80℃水浴鍋中攪拌30 min后過濾，重復(fù)脫色2次，得脫色后的多糖粗品溶液。

2.2.2 Sevag法脫蛋白[4]加入相當(dāng)于前一步驟所得多糖水溶液1/4體積的氯仿，再加入相當(dāng)于氯仿1/4體積的正丁醇，將混合物劇烈震蕩20～30min，然后靜置分離，通過分液漏斗除去含有變性蛋白的溶劑層，保留水層，如此重復(fù)3次，脫去蛋白質(zhì)。將脫蛋白質(zhì)的多糖溶液用恒溫磁力攪拌器濃縮成膏狀后，用電熱恒溫旋風(fēng)干燥箱烘干，即得樣品多糖記為w1，稱量w1=0.256 0 g。

2.3 艾葉多糖含量測定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定

2.3.1.1 精密量取5.00 mL苯酚，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，得5.0%的苯酚溶液。

2.3.1.2 精確稱量0.010 g葡萄糖，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，得 0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 精確量取葡萄糖對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)溶液依次為5.00、10.00、20.00、30.00、35.00 mL，置50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，分別稀釋成10、20、40、60、70 μg/mL的 5個(gè)不同濃度的對(duì)照品系列溶液。分別準(zhǔn)確量取1.00 mL樣品液5份，分別置于10 mL具塞比色管中，加1.50 mL苯酚溶液，再加7.50 mL濃硫酸溶液，混合均勻后放置20 min，用722N型可見光光度計(jì)，在486 nm測其吸光度（A），以對(duì)照品濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程，結(jié)果見表1和圖1。

表1 紫外可見分光光度計(jì)測葡萄糖對(duì)照液吸光度

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)以上數(shù)據(jù)以及作圖求得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：

相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。

2.3.3 艾葉多糖提取率測定（苯酚-硫酸法[5-6]） 精確稱取艾葉粗多糖0.010 g置于10 mL試管中，加入1 mol/L H2SO42 mL，沸水浴水解2 h，冷卻至室溫，移至 100 mL容量瓶，蒸餾水定容至刻度。按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，分別精密量取1.0 mL樣品液5份，分別置于10 mL具塞比色管中，加1.5 mL 5.0%苯酚溶液，再加7.5 mL濃硫酸溶液，混合均勻后放置 20 min，用可見分光光度計(jì)在486 nm處測其A值，由回歸方程計(jì)算艾葉中多糖的含量，測定結(jié)果如表2。

表2 紫外可見分光光度計(jì)平行測定艾葉多糖溶液的A值

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖線性回歸方程，可以計(jì)算出艾葉多糖相當(dāng)于葡萄糖的濃度，如上表所示。平均濃度C=0.622 μg∕mL。

按下式計(jì)算艾葉粗多糖與葡萄糖之間的換算因子F：

式中W為稱取粗多糖的質(zhì)量 (μg)，D為粗多糖稀釋倍數(shù)(實(shí)驗(yàn)中D=1 000)，求得F為16.08。

粗多糖提取率的計(jì)算方法[7]如下：

粗多糖提取率(%)=[C×D×F×K／W0×106]×100

式中：C為粗多糖浸提液通過苯酚-硫酸法測定A值再從回歸方程求得的粗多糖相當(dāng)于葡萄糖的含量(μg)；D為稀釋倍數(shù)(實(shí)驗(yàn)中D=1 000)；F為換算因子 （F=16.08）；K為艾葉制備的樣品多糖w1與稱量的0.010 g艾葉多糖的比值 （K= 25.6）；W0為艾葉干粉質(zhì)量。

代入數(shù)據(jù)計(jì)算得：粗多糖提取率（%）=2.56%。

2.3.4 回收率的測定 按2.3.2方法，分別量取1、10、20、40、60、70 μg∕mL 5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液，置于 10 mL具塞比色管中，加 1.50 mL 5.0%苯酚溶液，再加 7.50 mL濃硫酸溶液，混合均勻后放置20 min，再分別加入2.3.3中的粗多糖溶液0.1 mL，用可見分光光度計(jì)在486 nm處測其吸光度值，結(jié)果回收率為 98.45%，RSD= 0.391%（n=5）。

2.4 羥基自由基的清除

2.4.1 艾葉樣品多糖溶液的配制 精確稱取0.246 0 g艾葉樣品多糖，放置燒杯中，用少量50℃熱水完全溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用蒸餾水定容，即得濃度為C=4.92 mg/mL的多糖樣品溶液。

2.4.2 清除羥自由基的測定 Fenton反應(yīng)是生物體內(nèi)存在的·OH體外模式反應(yīng)。參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型[8]，利用 H2O2與 Fe2+混合產(chǎn)生·OH（反應(yīng)式H2O2+Fe2+→Fe3++·OH+OH-）。Fe2+與 1，10-菲羅啉在 pH 2～ 9的范圍內(nèi)可形成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物，在510 nm處有最大吸收。當(dāng)加入艾葉多糖溶液時(shí)，艾葉多糖能清除溶液中游離的·OH，因而可以通過測量A值間接計(jì)算出樣品艾葉多糖對(duì)·OH的清除率。

A0：不加H2O2，而加入樣品時(shí)的A值。

A1：加入H2O2，但不加樣品時(shí)的A值。

A2：加入H2O2和樣品時(shí)的A值。

采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，在10 mL具塞比色管中依次加入0.2mL1，10-菲羅啉（5mmol/L），1 mL Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 6.0），0.2 mL硫酸亞鐵（7.5 mmol/L），0.2 mL H2O2（1%）和不同體積的艾葉溶液，無水乙醇定容到10 mL，然后于37℃超級(jí)恒溫水浴中反應(yīng)60 min，在510 nm處測量A值，平行3次。

表3 艾葉多糖清除·OH的清除率

根據(jù)表3可繪制艾葉多糖溶液對(duì)清除·OH的清除率變化曲線圖。

圖2 艾葉多糖濃度與清除率的變化關(guān)系

從圖2中可看出，艾葉多糖溶液對(duì)由Fenton體系產(chǎn)生的·OH有一定的清除作用，隨著艾葉多糖濃度的增加，對(duì)·OH自由基的清除能力也增強(qiáng)。說明艾葉多糖與·OH自由基清除有一定的量效關(guān)系，即艾葉多糖濃度增加時(shí)，其清除率也增大。

3 結(jié)論與展望

3.1 艾葉中含有一定量的多糖，其多糖提取率為2.56%，回收率為98.45%，RSD=0.391%（n=5）。

3.2 艾葉多糖對(duì)·OH具有較好的清除作用，且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。多糖具有良好的抗氧化和清除自由基的功能，且不良反應(yīng)較小。艾葉多糖所具有的抗氧化活性使其有望作為天然抗氧化劑而得到很好的開發(fā)應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)對(duì)艾葉多糖所進(jìn)行的含量測定及抗氧化研究，希望能為進(jìn)一步促進(jìn)廣西艾葉植物資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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Study on the Extraction of Polysaccharides from Artemisiae Argyi Folum and the Effects on Scavenging of Hydroxyl Radicals

Tan Bing1,Yan Huanning1,Huang Suoyi1，Liao Huixian2,Zhang Qiang2（1 Pharmacy Department of Youjiang Medical University for Nationalities,Guangxi Baise 533000,China；2 Department of Clinical Medicine of Youjiang Medical University for Nationalities）

Objective：To analyze the extraction of polysaccharides from Artemisiae argyi folum，the content determination and the effects on hydroxyl radical scavenging. Methods：To extract Artemisiae argyi folum polysaccharides using hot water extraction and followed by purification.To determine the content using phenol-sulfuric acid method and the effects on scavenging of hydroxyl radicals by hydroxyl radical scavenging test.Results:The content of Artemisiae argyi folum polysaccharides was 2.56%and the recovery rate was 98.45% (RSD=0.391%,n=5).The Artemisiae argyi folum polysaccharides solution showed the effects on scavenging of hydroxyl radicals produced by the Fenton system.With the increasing concentration of Artemisiae argyi folum polysaccharides the scavenging ability of hydroxyl radicals increased.Conclusion：Artemisiae argyi folum contained a certain amount of polysaccharides and the scavenging ability of hydroxyl radicals was proved with good dose-effect relationship within a certain range.

Artemisiae Argyi Folum Polysaccharide；Extraction；Content Determination；Hydroxyl Radical Scavenging

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.03.003

2011-11-15）

譚冰，女，本科在讀。研究方向：天然產(chǎn)物有效成分提取及活性研究、中草藥有效成分的研究。E-mail：790221072@qq.com

黃鎖義，男，教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)、藥物化學(xué)、食品衛(wèi)生。通迅作者E-mail：huangsuoyi@163.com