表皮生長因子和表皮生長因子受體與大鼠自然妊娠和早產(chǎn)的關(guān)系▲

甘國才 李慕軍 吳 浪

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，南寧市 530021，電子郵箱：652913935@qq.com)

早產(chǎn)是指妊娠滿28周至不足37周分娩者，早產(chǎn)兒各項(xiàng)身體機(jī)能尚未發(fā)育成熟，易導(dǎo)致新生兒殘疾和死亡。早產(chǎn)導(dǎo)致的新生兒死亡率高達(dá)5%～15%，其中約15%的早產(chǎn)兒死于新生兒期，在新生兒死亡中位居第二位[1-4]。因此，預(yù)測和預(yù)防早產(chǎn)，改善早產(chǎn)兒的預(yù)后和治療是婦產(chǎn)科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。目前，關(guān)于早產(chǎn)預(yù)測因子的研究有很多，包括宮頸評價、胎兒纖維連接蛋白、各類細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和C反應(yīng)蛋白等[5-6]。但尚無明確的指標(biāo)及統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測早產(chǎn)。本研究通過建立SD大鼠妊娠和早產(chǎn)模型，探討孕鼠模型血清、羊水表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)水平和胎盤表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)相對含量對早產(chǎn)的預(yù)測價值，為臨床早產(chǎn)的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取16只12～15周齡SD雌性大鼠和8只18～20周齡SD雄性大鼠，均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SYXK桂2016-0005。雌鼠體質(zhì)量300～380 g，雄鼠體質(zhì)量450～500 g。所有大鼠均飼養(yǎng)在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，由專門飼養(yǎng)員喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度22℃～28℃，濕度適中，保持良好的通風(fēng)環(huán)境。

1.2 分組 采用數(shù)字表法將雄鼠隨機(jī)分為兩組，兩組輪流與雌鼠交配，同一組雄鼠的兩次交配間隔時間均為3 d。交配成功后，將16只SD雌性大鼠按不同孕齡分為A、B、C、D 4個組，每組4只，其中A組為中孕組(孕12 d)，大鼠編號依次為A1～A4，B組為晚孕組(孕17 d)，依次編號為B1～B4，C組為妊娠組(孕21 d)，依次編號為C1～C4，D組為早產(chǎn)組(孕17 d)，依次編號為D1～D4。在大鼠背部和四肢用結(jié)晶紫標(biāo)記。

1.3 主要試劑和儀器 脂多糖購自北京Solarbio科技有限公司(批號：L8880)；RNA保護(hù)液購自北京Solarbio科技有限公司(批號：SR0020)；酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司(批號：239380441)；RNA反轉(zhuǎn)錄盒購自Thermo Scientific(批號：00621709)；TRIzol試劑購自Invitrogen公司(批號：180401)；熒光定量PCR試劑盒購自QIAGEN(批號：154045739)。PCR儀購自美國Applied Biosystems(型號：7500)。引物的設(shè)計和生產(chǎn)均購自維爾凱生物科技有限公司，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模方法及造模成功評價標(biāo)準(zhǔn)：把大鼠按雌雄2 ∶1合籠，合籠時間為18:00到第二天9:00。檢查交配情況：(1)第二天9:00查看陰栓的同時進(jìn)行陰道涂片，染色風(fēng)干后立即進(jìn)行鏡下觀察，若雌鼠陰道口有乳白色陰栓，或陰道涂片后可鏡下觀察到精子則視為交配成功；(2)在孕中期(孕10～14 d)，可通過深觸診摸到雌鼠下腹部串珠樣胚胎，則可視為交配成功并受孕。交配成功當(dāng)天視為懷孕的第1天。早產(chǎn)組在孕17 d的時候，給予0.04 mg/ml脂多糖腹腔注射，注射量為400 μg/kg，每3 h觀察1次，若發(fā)現(xiàn)陰道流液或流血則視為早產(chǎn)。

1.4.2 標(biāo)本采集：中孕組于孕第12天、晚孕組于孕第17天、妊娠組于孕第21天、早產(chǎn)組于孕第17天收集胎盤、羊水及靜脈血標(biāo)本：在解剖孕鼠取胎盤和羊水之前，先用毛細(xì)玻璃管在孕鼠眼眶內(nèi)眥靜脈各取靜脈血2 ml；取靜脈血后，經(jīng)孕鼠下腹部解剖孕鼠，用5 ml注射器各抽取羊水2 ml，然后打開子宮，取胎盤若干。獲取標(biāo)本后，靜脈血即用干燥管收集，羊水即用15 ml離心管收集，均分別于24 h內(nèi)3 500 r/min離心15 min，取上層血清，分裝至若干EP管后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。胎盤用生理鹽水沖洗，立即放入RNA保護(hù)液浸泡，于24 h后取出，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ糜谔K木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色的胎盤則立即放入10%福爾馬林溶液中浸泡，并放置于4℃冰箱保存，直至行HE染色處理。

1.4.3 檢測方法：采用雙抗夾心法分別檢測羊水和血清中的EGF水平，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用芬蘭Thermo Scientific公司生產(chǎn)的Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀檢測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算待測標(biāo)本含量。采用實(shí)時熒光定量PCR(realtime quantitative PCR，RT-qPCR)檢測各組胎盤組織中EGFR基因含量，采用美國Applied Biosystems公司生產(chǎn)的PCR儀(型號：7500)檢測樣本中EGFR的相對表達(dá)量，采用2-ΔΔCt法計算相對定量結(jié)果。2-ΔΔCt值反映各樣品相對空白組樣品目的基因的相對表達(dá)水平：ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值；ΔΔCt=各樣品ΔCt值-空白組ΔCt值的平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胎盤HE染色結(jié)果 早產(chǎn)組和妊娠組可見明顯的血管充血，在早產(chǎn)組中血管之間和絨毛之間可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，表現(xiàn)出絨毛膜炎的病理改變。中孕組和晚孕組血管充血不明顯，中孕組可見碩大的滋養(yǎng)葉細(xì)胞。見圖1～4。

圖1 早產(chǎn)組(HE染色,×10)圖2 中孕組(HE染色,×10)圖3 晚孕組(HE染色,×10)圖4 妊娠組(HE染色,×10)

2.2 4組大鼠血清和羊水EGF水平比較 4組大鼠血清EGF水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中妊娠組血清EGF水平均高于早產(chǎn)組、中孕組和晚孕組(均P<0.05)，早產(chǎn)組、中孕組和晚孕組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。4組大鼠羊水EGF水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中早產(chǎn)組和中孕組均低于晚孕組和妊娠組(均P<0.05)，但早產(chǎn)組和中孕組比較、晚孕組和妊娠組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠血清、羊水EGF水平比較(x±s)

注：與妊娠組比較，#P<0.05；與晚孕組比較，*P<0.05；與妊娠組比較，△P<0.05。

2.3 4組大鼠胎盤EGFR相對表達(dá)量比較 4組的胎盤EGFR相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中妊娠組均高于早產(chǎn)組、中孕組和晚孕組(均P<0.05)，但早產(chǎn)組、中孕組和晚孕組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 4組大鼠EGFR相對表達(dá)量比較(x±s)

注：與妊娠組比較，#P<0.05。

2.4 血清、羊水EGF及胎盤EGFR的相關(guān)性分析 大鼠胎盤EGFR相對表達(dá)量與血清EGF水平呈正相關(guān)(r=0.759，P=0.001)，與羊水EGF水平也呈正相關(guān)(r=0.590，P=0.016)；血清EGF水平與羊水EGF水平呈正相關(guān)(r=0.570，P=0.021)。

3 討 論

早產(chǎn)是引起新生兒死亡的主要原因之一[7]，部分發(fā)達(dá)國家中，約75%的新生兒第一個月的死因?yàn)樵绠a(chǎn)[8]，因此，如何科學(xué)準(zhǔn)確地預(yù)測早產(chǎn)是當(dāng)前婦產(chǎn)科醫(yī)生面臨的主要問題之一。EGF是一種通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞分化和胎兒肺表面活性物質(zhì)合成的重要調(diào)節(jié)劑，在促進(jìn)胎兒肺成熟的發(fā)育過程中具有重要作用[9]。EGF存在于大多數(shù)組織和體液中[10]，隨著妊娠的進(jìn)展，母體中的EGF不斷變化，其在各個組織中的表達(dá)也不相同。生殖系統(tǒng)中的EGF及其受體EGFR由自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌途徑產(chǎn)生，對生殖器官及生殖激素產(chǎn)生調(diào)控作用，從而影響性腺功能、胎兒發(fā)育及胎盤功能等。EGFR在孕早期廣泛分布于胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞中，并且通過EGFR信號通路調(diào)節(jié)人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖[11]。目前，EGF被廣泛應(yīng)用于流產(chǎn)和子宮肌瘤的研究，但EGF在預(yù)測早產(chǎn)方面卻鮮有報道。

有研究發(fā)現(xiàn)，與孕中期相比，孕晚期羊水中的EGF水平增高，但在尿液中結(jié)果卻相反，因此認(rèn)為羊水中的EGF來源與尿液中的EGF來源是相互獨(dú)立的[12]。但在本研究中，無論是血液還是羊水，妊娠組大鼠的EGF水平均高于中孕組，即越接近臨產(chǎn)，EGF的水平反而越高，考慮可能與標(biāo)本來源不同或檢測方法不同有關(guān)。有研究顯示，EGF、催乳素、4-羥基雌二醇聯(lián)合治療可改善小鼠胚泡植入率，但單獨(dú)使用其中一個因素卻無效[13]。這表明EGF在孕早期需聯(lián)合其他因子一起激活相關(guān)途徑才能產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。Allen等[14]對馬的妊娠過程進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，從妊娠第20天開始子宮內(nèi)膜腺和內(nèi)膜上皮中EGF的表達(dá)便顯著增加，其受體EGFR在滋養(yǎng)細(xì)胞表面強(qiáng)烈表達(dá)，因此認(rèn)為在馬的妊娠過程中，母體生長因子EGF與母體和胎兒分泌的雌激素協(xié)同作用，可促進(jìn)胎盤的快速生長，并且這種因子在妊娠期間持續(xù)分泌，使馬能在足月時生產(chǎn)出較為成熟的新生兒駒。因此，無論是在羊水還是血液，EGF的含量均應(yīng)逐漸升高，以促進(jìn)胎盤和胎兒的不斷成熟。在本研究中，我們以SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，通過實(shí)驗(yàn)干預(yù)造成晚孕期大鼠早產(chǎn)，然后收集各組標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測。結(jié)果顯示，妊娠組血清EGF水平均高于早產(chǎn)組、中孕組和晚孕組(均P<0.05)，而早產(chǎn)組、中孕組和晚孕組血清EGF比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。早產(chǎn)組和中孕組羊水EGF水平均低于晚孕組和妊娠組(均P<0.05)，而早孕組和中孕組以及晚孕組和妊娠組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。妊娠組胎盤EGFR相對表達(dá)量均高于其他3組(均P<0.05)，結(jié)果與血清EGF的檢測結(jié)果相近。這表明EGF和EGFR在妊娠的維持和發(fā)展中扮演著十分重要的作用，隨著妊娠的發(fā)展，血液、羊水和胎盤中的EGF及其受體均逐漸升高。但當(dāng)早產(chǎn)發(fā)生時，這種趨勢卻會發(fā)生改變。Armant等[15]研究結(jié)果顯示，當(dāng)EGF下降導(dǎo)致EGF信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)失調(diào)時，會引起滋養(yǎng)細(xì)胞不能順利侵入和重塑子宮螺旋動脈，并且會引起EGF受體拮抗劑的過表達(dá)，進(jìn)而引起相關(guān)的圍生期疾病。但本研究中晚孕組羊水EGF水平和妊娠組的比較卻沒有差異，這很可能是由于從晚孕期開始，胎兒快速走向最后的成熟階段，使得胎兒分泌EGF增多并且逐漸接近分娩期濃度。Villanueva-García等[16]研究顯示，孕19 d胎鼠的EGFR信號傳導(dǎo)對肺成熟起重要作用，EGF及EGFR配體在肺成纖維細(xì)胞中大量表達(dá)并通過激活特異性蛋白激酶C促進(jìn)胎鼠肺成熟?？紤]可能由于孕晚期胎兒肺成熟需要，使羊水中的EGF含量升高甚至接近于分娩期，因此晚孕組羊水EGF水平與妊娠組水平無明顯差異，而由于胎盤屏障作用，羊水中的EGF很難影響到母體血液中的EGF水平。胎盤中EGFR相對表達(dá)量與靜脈血EGF濃度相近，可能提示胎盤EGFR的表達(dá)主要受血液EGF濃度的影響。

本研究中，大鼠血清EGF水平、羊水EGF水平及胎盤EGFR相對表達(dá)量之間均呈正相關(guān)(均P<0.05)。國內(nèi)有研究報道，在人工流產(chǎn)和自然流產(chǎn)血清和胎盤中EGF和EGFR水平均呈同步性，即自然流產(chǎn)的EGF和EGFR均比人工流產(chǎn)低，當(dāng)發(fā)生自然流產(chǎn)時，血液EGF含量和胎盤EGFR水平均同步下降[17-19]。有研究報道，在早產(chǎn)和早產(chǎn)性先兆子癇血清中的EGF和其配體EGFR會顯著下降，這可能是機(jī)體對于早產(chǎn)的一種保護(hù)性反應(yīng)[20]。

綜上所述，EGF和EGFR在整個妊娠發(fā)展過程中不斷變化，但其在不同的組織中的變化不同。在孕晚期血液和胎盤中的EGF和EGFR水平出現(xiàn)異常降低可能預(yù)示著早產(chǎn)。本研究僅在大鼠模型中進(jìn)行，且樣本量有限，結(jié)論具有一定的局限性，EGF和EGFR與自然妊娠和早產(chǎn)的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究闡明。