特立帕肽通過Wnt3a/β-catenin通路對高糖環(huán)境下成骨細胞分化的影響

谷營營，侯 甜，秦雅芝，張 妍，溫國琛，畢文娟，董 偉

糖尿病性骨質(zhì)疏松癥(diabetic osteoporosis，DOP)是糖尿病常見并發(fā)癥，其發(fā)病因素包括成骨細胞功能降低[1]和糖基化終末產(chǎn)物積累[2]，目前臨床上主要通過降糖藥配合抗骨質(zhì)疏松藥進行治療，尚無更具有針對性的治療藥物，臨床治療效果仍待提高。Wnt信號通路是多種骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的重要通路，通過影響骨穩(wěn)態(tài)平衡調(diào)控骨質(zhì)疏松的發(fā)生[3]。研究[4]表明，Wnt/β-catenin信號通路可通過調(diào)節(jié)細胞胞質(zhì)內(nèi)β-catenin表達量影響成骨細胞増殖分化。高糖狀態(tài)下Wnt/β-catenin通路表達異常后會干預成骨細胞分化，影響DOP的骨形成及代謝[5]。

特立帕肽(teriparatide，TPTD)與甲狀旁腺激素[PTH(1-84)]的前34個氨基酸分子相同，是一種用于治療重度骨質(zhì)疏松癥的促骨形成類首選藥物，能夠促進骨形成，提高骨量[6]。臨床上，TPTD多用于絕經(jīng)后重度骨質(zhì)疏松癥及伴發(fā)骨折的治療，治療效果理想[7]，但尚未發(fā)現(xiàn)其影響DOP的分子學及臨床實驗研究。該實驗通過誘導MC3T3-E1細胞在高糖條件下成骨分化，同時加入TPTD及Wnt3a抑制劑，觀察TPTD對高糖環(huán)境下成骨細胞分化的影響及Wnt3a/β-catenin通路在其中的調(diào)控作用，以期為臨床上TPTD成為DOP的潛在治療藥物提供細胞學理論研究基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞小鼠MC3T3-E1細胞，為成骨細胞前體細胞，可誘導分化為成骨細胞(中科院上海細胞庫)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和實驗分組 實驗分為5組：低糖組(5.5 mmol/L葡萄糖)、低糖+TPTD組(5.5 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L TPTD)、高糖組(16.5 mmol/L葡萄糖)、高糖+TPTD組(16.5 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L TPTD)、高糖+TPTD+G244-LM組(16.5 mmol/L葡萄糖+10 nmol/L TPTD+0.1 μmol/L G244-LM)。MC3T3-E1細胞培養(yǎng)至含15%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，在細胞接種且貼壁后，更換為含有成骨誘導液(10 nmol/L地塞米松溶液+50 μmol/L抗壞血酸溶液+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉溶液)的新鮮培養(yǎng)基，并按照分組加入TPTD溶液及Wnt3a抑制劑G244-LM。

1.2.2細胞增殖實驗 5組細胞于96孔板中培養(yǎng)24、48、72 h后，加入CCK-8溶液，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h后，測定490 nm處的吸光度值，并按照數(shù)據(jù)繪制5組細胞的生長曲線圖。5組細胞培養(yǎng)3d后，PBS沖洗3次，加入鈣黃綠素乙酰氧基甲酯(calcein acetoxymethyl ester，Calcein-AM)染色工作液，室溫避光孵育20 min，熒光顯微鏡觀察細胞染色情況并進行細胞計數(shù)。

1.2.3成骨分化檢測 5組細胞培養(yǎng)7 d后，4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，NBT/BCIP堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑避光染色30 min，PBS沖洗3次，觀察各組細胞ALP染色情況。ALP試劑盒檢測各組細胞蛋白活性，酶標儀讀取各組數(shù)據(jù)。5組細胞培養(yǎng)21 d后，每孔加入4%多聚甲醛溶液于室溫固定15 min，1%茜素紅s染色20 min，PBS洗滌3次后觀察鈣化沉積情況。使用Image J軟件分析茜素紅陽性面積占總面積百分比。

1.2.4免疫熒光分析 5組細胞培養(yǎng)5 d后，4%多聚甲醛固定15 min，0.5% Triton X-100溶液透化細胞15 min，室溫下加入FITC-phalloidin孵育3 h后，用5 μg/ml DAPI室溫孵育5 min后，觀察各組細胞肌動蛋白形成情況。

1.2.5實時熒光定量PCR分析 將各組細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix進行Real-time PCR，PCR產(chǎn)物用StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)(美國賽默飛世爾科技公司)檢測。選用GAPDH作為內(nèi)參基因。反應程序：95 ℃、1 min，95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、45 s，共40個循環(huán)。以2-ΔΔCT法分析測定基因表達水平，引物序列見表1。

表1 實時定量PCR目的基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 TPTD對高糖條件下MC3T3-E1細胞增殖活性的影響應用CCK-8法測定5組細胞培養(yǎng)24、48、72 h后各組細胞增殖情況。結(jié)果顯示，各組細胞增殖活性結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(F=0.985，P>0.05)。見圖1、表2。提示TPTD對高糖環(huán)境下各組細胞增殖活性無影響。

圖1 CCK-8實驗檢測細胞培養(yǎng)24、48、72 h后各組細胞的生長增殖曲線

表2 CCK-8檢測高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞增殖活性

5組細胞培養(yǎng)3 d后，進行Calcein-AM染色觀察細胞增殖趨勢。各組細胞計數(shù)結(jié)果分別為：低糖組(437.43±37.19)個，低糖+TPTD組(494.13±66.04)個，高糖組(401.20±44.42)個，高糖+TPTD組(409.90±79.08)個，高糖+TPTD+G244-LM組(342.06±53.42)個。各組細胞計數(shù)結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(F=2.742，P>0.05)。見圖2。提示各組細胞增殖趨勢無明顯差異。

圖2 各組細胞培養(yǎng)3 d后Calcein-AM染色觀察細胞增殖 Calcein-AM染色 ×40 A：低糖組；B：低糖+TPTD組；C：高糖組；D：高糖+TPTD組；E：高糖+TPTD+G244-LM組

2.2 TPTD對高糖條件下成骨細胞分化的影響5組細胞培養(yǎng)7 d后，進行ALP染色及蛋白活性檢測。ALP染色結(jié)果顯示：各組細胞都存在不同程度的成骨分化現(xiàn)象，其中，低糖+TPTD組細胞染色區(qū)域高于其他四組，細胞分化狀態(tài)較好(P<0.05)；高糖組細胞分化較少，明顯低于高糖+TPTD組和低糖組細胞的分化結(jié)果(P<0.05)；高糖+TPTD組染色區(qū)域高于高糖組和高糖+TPTD+G244-LM組(P<0.05)，見圖3。蛋白定量檢測結(jié)果(U/g)為：低糖組(0.508±0.006)，低糖+TPTD組(0.767±0.026)，高糖組(0.382±0.019)，高糖+TPTD組(0.449±0.022)，高糖+TPTD+G244-LM組(0.213±0.008)(F=449.804，P<0.05)。結(jié)果提示高糖抑制成骨細胞ALP分化及蛋白活性，TPTD促進成骨細胞ALP分化及蛋白活性；高糖+TPTD組加入Wnt3a抑制劑后，成骨細胞分化量減少，蛋白活性降低。

圖3 各組細胞培養(yǎng)7 d后ALP染色后觀察A：低糖組；B：低糖+TPTD組；C：高糖組；D：高糖+TPTD組；E：高糖+TPTD+G244-LM組；1：×40；2：×100

5組細胞培養(yǎng)21 d后，進行茜素紅s染色。結(jié)果顯示，低糖組(16.82%±0.98%)、低糖+TPTD組(32.40%±1.09%)、高糖組(11.79%±1.28%)、高糖+TPTD組(19.26%±0.78%)、高糖+TPTD+G244-LM組(7.51%±1.15%)各組細胞染色陽性區(qū)域比組間差異有統(tǒng)計學意義(F=235.692，P<0.05)。見圖4。低糖+TPTD組細胞染色陽性區(qū)域比最高(P<0.05)；高糖組細胞染色陽性區(qū)域比低于低糖組(P<0.05)，高糖+TPTD組細胞染色陽性區(qū)域比高于高糖+TPTD+G244-LM組(P<0.05)。以上結(jié)果表明：高糖抑制成骨細胞分化；TPTD的加入促進成骨細胞分化；在高糖+TPTD組加入Wnt3a抑制劑后，成骨細胞分化水平降低。

圖4 細胞培養(yǎng)21 d后進行茜素紅s染色結(jié)果A：低糖組；B：低糖+TPTD組；C：高糖組；D：高糖+TPTD組；E：高糖+TPTD+G244-LM組；1：×40；2：×100

2.3 TPTD對高糖條件下成骨細胞肌動蛋白的影響5組細胞培養(yǎng)5 d后，免疫熒光染色結(jié)果顯示，低糖+TPTD組細胞骨架最清晰；高糖組和高糖+TPTD+G244-LM組細胞骨架清晰程度均低于高糖+TPTD組。見圖5。結(jié)果表明，高糖降低MC3T3-E1細胞細胞骨架清晰程度；TPTD的加入提高了細胞骨架清晰程度；Wnt3a抑制劑明顯降低高糖+TPTD組細胞骨架清晰程度。

圖5 5組細胞細胞骨架FITC-phalloidin染色及細胞核DAPI染色觀察 ×400A：低糖組；B：低糖+TPTD組；C：高糖組；D：高糖+TPTD組；E：高糖+TPTD+G244-LM組

2.4 TPTD對高糖條件下成骨相關(guān)基因mRNA表達的影響5組細胞進行Real-time PCR檢測結(jié)果顯示：低糖+TPTD組細胞Wnt3a、β-catenin、Tcf1、OPG、COLⅠ mRNA水平最高；低糖組各基因mRNA水平均高于高糖組；高糖+TPTD組細胞各基因mRNA水平均高于高糖組和高糖+TPTD+G244-LM組。見圖6。結(jié)果表明，高糖抑制成骨細胞Wnt3a、β-catenin、Tcf1、OPG、COLⅠ mRNA表達；加入TPTD后促進成骨細胞上述各基因mRNA表達；加入Wnt3a抑制劑后各基因mRNA表達均降低。

圖6 5組細胞進行Real-time PCR分析結(jié)果A：低糖組；B：低糖+TPTD組；C：高糖組；D：高糖+TPTD組；E：高糖+TPTD+G244-LM組；與低糖組比較：*P<0.05；與高糖組比較：&P<0.05；與高糖+TPTD組比較：#P<0.05

3 討論

該研究表明高糖抑制成骨細胞分化，同時抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因Wnt3a、β-catenin、Tcf1、OPG、COLⅠ mRNA表達；TPTD可促進高糖環(huán)境下成骨細胞分化，提高上述各基因mRNA表達。

有研究[8]通過檢測糖尿病模型中細胞焦亡相關(guān)因子的表達，表明高血糖可通過細胞焦亡途徑抑制成骨細胞的增殖和分化；同時研究ME3T3-E1細胞顯示，高血糖可通過Caspase-1/GSDMD/IL-1β途徑抑制成骨細胞增殖分化。Wu et al[9]在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，高血糖小鼠體內(nèi)成骨分化相關(guān)基因ALP和Runx2蛋白的表達明顯降低，成骨分化受到抑制。研究[10]表明，高糖抑制MC3T3-E1細胞向成骨分化，抑制成骨標志物Runx2、COL Ⅰ表達。但目前高糖抑制成骨細胞分化的具體分子機制尚在研究。該實驗通過高糖培養(yǎng)基與低糖培養(yǎng)基分別培養(yǎng)成骨細胞前體MC3T3-E1細胞，觀察在高糖水平下成骨細胞增殖活性及分化礦化水平是否受到影響，結(jié)果顯示，高糖水平下各組細胞增殖活性不具有統(tǒng)計學差異，但高糖會降低成骨細胞分化及礦化結(jié)節(jié)形成水平。Wnt/β-catenin通路在成骨微環(huán)境中起重要作用[11]，Wnt3a是Wnt/β-catenin通路的重要組成部分，通過調(diào)控β-catenin的表達量參與多項成骨分化相關(guān)研究。Deshmukh et al[12]研究表明，Wnt3a可通過調(diào)控其下游β-catenin因子影響Wnt3a/β-catenin通路下游靶基因，參與間充質(zhì)細胞向成骨細胞和軟骨細胞分化的平衡。Feng et al[13]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素生長因子-1(IGF-1)可通過Wnt/β-catenin途徑，經(jīng)Wnt3a、β-catenin、cyclinD1、Runx2、OPN等因子促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及骨質(zhì)發(fā)生分化。那么，Wnt3a是否可以通過干預β-catenin表達量在高糖環(huán)境下對成骨細胞發(fā)揮作用尚未可知。該實驗通過加入Wnt3a抑制劑，探究了其是否參與了高糖環(huán)境下成骨細胞分化作用，結(jié)果顯示抑制Wnt3a表達后，β-catenin及其下游Tcf1表達量隨之降低，成骨分化相關(guān)基因OPG及COLⅠ表達亦受到抑制，說明Wnt3a/β-catenin通路參與了高糖環(huán)境下成骨細胞分化過程。

研究[14]表明，PTH(1-84)可以通過與Wnt配體共用一個受體β-catenin信號發(fā)揮作用。小鼠體內(nèi)PTH(1-84)受體過表達，會導致Wnt/β-catenin通路下游基因表達增加，促進成骨細胞增殖，減少其凋亡[15]；但TPTD作為治療骨質(zhì)疏松癥的PTH(1-34)的重組骨代謝藥物，能否通過Wnt/β-catenin通路參與MC3T3-E1細胞成骨分化過程尚未有明確報道。該實驗通過在高糖環(huán)境下加入藥物TPTD及Wnt3a抑制劑進行干預，觀察MC3T3-E1細胞成骨分化及細胞骨架情況。ALP染色及蛋白活性定量、茜素紅s染色和免疫熒光實驗結(jié)果顯示，高糖+TPTD組細胞成骨分化水平及細胞骨架清晰度優(yōu)于高糖組及高糖+TPTD+Wnt3a抑制劑組；Real-time PCR結(jié)果顯示高糖+TPTD組細胞Wnt3a、β-catenin、Tcf1、OPG、COLⅠ 各基因mRNA表達量高于高糖組和高糖+TPTD+Wnt3a抑制劑組，提示TPTD可通過Wnt3a/β-catenin通路調(diào)控成骨細胞分化。

綜上所述，該研究表明，高糖降低成骨細胞分化水平及細胞骨架清晰程度，抑制Wnt3a及其下游β-catenin、Tcf1、OPG及COLⅠ表達；TPTD可通過調(diào)控Wnt3a/β-catenin信號通路促進高糖環(huán)境下MC3T3-E1細胞成骨分化，提高細胞骨架清晰程度，提高上述通路相關(guān)基因表達。該研究為臨床上TPTD成為DOP潛在治療藥物提供了理論基礎，并說明Wnt3a/β-catenin信號通路有潛力成為治療DOP的新靶點。