Nodal及其受體在不同發(fā)育期小鼠組織器官中的表達(dá)*

王 軻,朱 敏,顧 洪,李念峰,胡湘麟,曾凡才△

(西南醫(yī)科大學(xué)：1.臨床醫(yī)學(xué)院； 2.康復(fù)醫(yī)學(xué)系；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000)

Nodal生長(zhǎng)分化因子(Nodal)作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族的一員，是一種主要通過(guò)自分泌和旁分泌經(jīng)細(xì)胞膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用的細(xì)胞因子[1]。經(jīng)典的Nodal信號(hào)通路為兩分子成熟形式Nodal先形成同源二聚體，然后與兩分子Ⅱ型受體ACTRⅡA或ACTRⅡB結(jié)合形成四聚體，再招募兩分子Ⅰ型受體激活素受體樣激酶4(activin receptor-like kinase 4,ALK4)或激活素受體樣激酶7(activin receptor-like kinase 7,ALK7)形成六聚體復(fù)合體，復(fù)合體中的Ⅱ型受體使Ⅰ型受體ALK4或ALK7被磷酸化后激活，同時(shí)Cripto-1分子可能作為輔助受體參與Nodal信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[2]。激活的ALK4或ALK7可使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Smad2和Smad3分子發(fā)生磷酸化后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)并發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)[3]。

真核生物基因普遍存在選擇性剪接現(xiàn)象[4]?；蝾A(yù)測(cè)Nodal分子可能有兩種剪接異構(gòu)體，不過(guò)目前為止僅檢測(cè)到一種剪接異構(gòu)體蛋白，該剪接異構(gòu)體蛋白有前體(Pro-Nodal)和成熟肽(Nodal)兩種形式。ALK7是Nodal分子已知的兩個(gè)Ⅰ型受體之一，ALK7通過(guò)選擇性剪接可產(chǎn)生4種剪接異構(gòu)體，它們分別是：ALK7-1，ALK7-2，ALK7-3和ALK7-4[5]。ALK4是Nodal信號(hào)通路中的另一個(gè)Ⅰ型受體，剪接異構(gòu)體主要有ALK4-1和ALK4-2。Nodal分子的輔助受體Cripto-1僅觀察到一種剪接異構(gòu)體蛋白。

大量研究表明Nodal分子主要在動(dòng)物體胚胎發(fā)育和體軸左右不對(duì)稱(chēng)形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。最近也有研究發(fā)現(xiàn)Nodal分子在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程相關(guān)，并且認(rèn)為其可能是腫瘤診斷的標(biāo)志分子和治療靶點(diǎn)[7-9]。但是HOOIJKAAS等[10]卻提出由于Nodal在人腎臟組織中有較強(qiáng)表達(dá)，可能并不適于作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。由于人的正常組織器官不易獲取，目前還不十分清楚Nodal分子在其他正常組織器官中的表達(dá)情況，甚至也未見(jiàn)Nodal分子在動(dòng)物組織器官中表達(dá)分布的相關(guān)報(bào)道；此外，雖然已知Nodal分子在早期胚胎發(fā)育過(guò)程有重要作用，但是還不清楚Nodal分子在個(gè)體發(fā)育后期是否也同樣發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)基于上述兩個(gè)問(wèn)題，以小鼠為動(dòng)物模型，選取胎鼠、新生鼠、仔鼠、成年鼠4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期小鼠，用Western blot方法檢測(cè)其多種器官中Nodal及其受體ALK7、ALK4和輔助受體Cripto-1蛋白的表達(dá)，以探討Nodal及其受體在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究Nodal分子功能及其是否可作為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明小鼠，5～6周齡，體質(zhì)量26～30 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2主要儀器和試劑 SCIENTZ-Ⅱ型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝公司)，TGL-16R型低溫高速離心機(jī)(珠海黑馬公司)，F(xiàn)orma 900系列-86 ℃立式超低溫冰箱(Thermo公司)，DYCZ-24系列雙垂直蛋白電泳儀(北京六一儀器廠),GelDocXR+System(BIO-RAD公司)。苯甲基磺酰氟(PMSF)、RIPA裂解液均購(gòu)自碧云天研究所。0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore IPVH00010)、Nodal(sc-28913，Santa Cruz公司，1∶300)、ALK7(sc-135001，Santa Cruz公司，1∶300)、ALK4(ab64831，Abcam公司，1∶1 000)、Cripto-1(ab19917，Abcam公司，1∶1 000)、β-actin(BS6007M，Bioworlde公司，1∶10 000)。二抗：HRP標(biāo)記山羊抗兔(BS13278,Bioworlde公司,1∶5 000)，HRP標(biāo)記山羊抗鼠(BS12478,Bioworlde公司，1∶5 000)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型建立 從新購(gòu)進(jìn)的20只小鼠(雌雄各10只)中選擇6只(雌雄各3只)分為3組直接取各組織器官提取蛋白作為成年鼠組樣品，其中雌鼠只取乳腺組織蛋白樣品，其余組織器官樣品均來(lái)自雄鼠。剩下的14只(雌雄各7只)小鼠在23 ℃環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)兩周以保證其充分性成熟。兩周后，下午6點(diǎn)左右將剩下的14只小鼠按雌雄1∶1合為7籠，次日早上將雌鼠和雄鼠分開(kāi)，取3籠雌鼠標(biāo)記為胎鼠組，3籠雌鼠標(biāo)記為新生鼠組，1籠雌鼠標(biāo)記為仔鼠組后繼續(xù)飼養(yǎng)。將雌雄鼠分開(kāi)時(shí)記為孕0 d，飼養(yǎng)兩周后未見(jiàn)小鼠腹部明顯變大者繼續(xù)合籠。根據(jù)此方法，將3只孕鼠在孕第18天時(shí)做剖宮產(chǎn)，取出胎鼠并提取胎鼠各組織器官的蛋白樣品。將同一孕鼠的胎鼠組織收集在一起作為一組樣本，共收集到3組胎鼠組樣本；標(biāo)記為新生鼠組的3只孕鼠正常分娩后，在小鼠出生2.5～3.0 d時(shí)對(duì)新生小鼠進(jìn)行解剖，取其各組織器官，將同一胎新生鼠組織收集在一起作為一組樣本，共收集到3組新生鼠組織樣本；標(biāo)記為仔鼠組的那一只孕鼠生產(chǎn)的小鼠哺乳18 d，將其產(chǎn)下的同一胎仔鼠分為3組，解剖3組仔鼠并獲得仔鼠組各組織器官蛋白樣本。每個(gè)發(fā)育階段小鼠均有3組樣本，分別對(duì)各組樣本進(jìn)行檢測(cè)，蛋白表達(dá)分布結(jié)果基本一致，選擇其中具有代表性的一組予以展示。其中由于胎鼠、新生鼠、仔鼠個(gè)體器官很小，難以單獨(dú)進(jìn)行蛋白測(cè)定，因此將同組小鼠的同種器官收集在一起進(jìn)行蛋白檢測(cè)，成年鼠為單獨(dú)個(gè)體蛋白檢測(cè)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循中國(guó)科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2.2蛋白樣品制備 從活體取到組織后，將其迅速放入液氮速凍，然后將速凍的組織放入-80 ℃長(zhǎng)期保存。待制備蛋白樣品時(shí)從-80 ℃超低溫冰箱取出需要的組織，液氮下研磨，研磨好的組織裝在1.5 mL滅菌EP管內(nèi)。按照0.1 g組織加入1 mL的RIPA和10 L PMSF的比例加入RIPA和PMSF并用渦旋震蕩混勻器充分震蕩混勻，混勻后的混合液置于冰上裂解1.5 h，由于PMSF在水溶液中不穩(wěn)定，因此在裂解40 min左右補(bǔ)加一定比例的PMSF。隨后超聲破碎DNA，4 ℃，16 000 r/min離心取上清液并按一定比例加入Loading Buffer，沸水浴 5 min，分裝樣品，蠟?zāi)っ芊釫P管，-20 ℃保存，使用時(shí)取出融化、混勻、低速離心即可。

1.2.3Western blot 采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為10%。濕轉(zhuǎn)膜法，250 mA恒流將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)完膜后取出PVDF膜，用TBST洗膜5 min以洗去膜上的電轉(zhuǎn)液，并用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗過(guò)夜(12～16 h)。次日回收一抗，TBST洗膜3×10 min，之后室溫孵育二抗1 h，TBST 2×5 min再TBS 1×5 min洗二抗，ECL發(fā)光，X線片暗盒曝光并用GelDocXR+ System采集圖像。圖像采集和分析均來(lái)自于Image Lab software(Bio-Rad Laboratories;Version 4.0.1)。

2 結(jié) 果

2.1Nodal及其受體在胎鼠組織器官中的表達(dá)分布 取13種胎鼠組織器官進(jìn)行Western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)大腦、小腦、皮膚、肝、胰腺、骨骼肌和腎等多種器官中有不同程度Pro-Nodal蛋白表達(dá)，其中肝臟表達(dá)最強(qiáng)，大腦、小腦、胰腺、骨骼肌和腎臟表達(dá)較強(qiáng)，只有皮膚有少量表達(dá)，其余6種胎鼠組織器官未見(jiàn)Nodal蛋白表達(dá)(圖1)。在表達(dá)Nodal蛋白的幾種器官中，骨骼肌有少量Nodal受體ALK7-1和ALK4-1蛋白表達(dá)，以及較強(qiáng)的輔助受體Cripto-1蛋白表達(dá)。此外，在胎鼠骨骼肌中還檢測(cè)到ALK7的剪接異構(gòu)體ALK7-3和ALK4的剪接異構(gòu)體ALK4-2蛋白有較強(qiáng)表達(dá)。在胎鼠腎臟、肝臟和皮膚中檢測(cè)到ALK7-1蛋白表達(dá)。此外，這3種組織器官還不同程度地表達(dá)了ALK4和ALK7的其他剪接異構(gòu)體，肝臟還表達(dá)了較強(qiáng)的Cripto-1蛋白。大腦、小腦、胰等組織器官雖然表達(dá)Nodal蛋白，但是未檢測(cè)到ALK7-1和ALK4-1蛋白表達(dá)，只是不同程度表達(dá)了ALK7-1和ALK4-1以外的剪接異構(gòu)體蛋白，這3種器官均無(wú)Cripto-1蛋白表達(dá)。在不表達(dá)Nodal的器官中，胎鼠小腸、胸腺和心臟幾乎未能檢測(cè)到這幾種蛋白的表達(dá)，而肺、胃和膀胱有較強(qiáng)的ALK4-2表達(dá)，其中肺和胃還有較強(qiáng)Cripto-1蛋白表達(dá)。

圖1 Nodal及其受體在胎鼠組織器官中的表達(dá)分布

2.2Nodal及其受體在新生鼠組織器官中的表達(dá)分布 用Western blot方法共檢測(cè)14種新生鼠組織器官，其中大腦、小腦、肝、肺、皮膚、胰腺、脾、骨骼肌和心臟等9種器官中有不同程度的Pro-Nodal蛋白表達(dá)，與胎鼠一樣，肝臟有最強(qiáng)表達(dá)，并且還觀察到少量成熟Nodal蛋白表達(dá)(圖2)。在表達(dá)Nodal蛋白的9種器官中，皮膚、骨骼肌、心臟和腎臟中檢測(cè)到ALK7-1和ALK4-1蛋白表達(dá)。在肝臟中雖高表達(dá)Nodal蛋白，但未檢測(cè)到ALK7-1蛋白表達(dá)，不過(guò)有較強(qiáng)的ALK4-1和Cripto-1蛋白表達(dá)。大腦、小腦、肺和脾4種器官中雖然有較強(qiáng)的Nodal蛋白表達(dá)，但是無(wú)受體ALK7-1或 ALK4-1蛋白表達(dá)。小腸、胃、膀胱和胸腺4種器官均觀察到較強(qiáng)的受體ALK7-1蛋白表達(dá)，但是未檢測(cè)Nodal表達(dá)。

圖2 Nodal及其受體在新生鼠組織器官中的表達(dá)分布

2.3Nodal及其受體在仔鼠組織器官中的表達(dá)分布 在已檢測(cè)的14種仔鼠組織器官中，僅有大腦、小腦、肝、脾和腎等5種器官中有Nodal蛋白表達(dá)，可見(jiàn)仔鼠表達(dá)Nodal的器官明顯比新生鼠更少(圖3)。此外，在肝和腎主要觀察到的是成熟Nodal蛋白而不是前體蛋白，這也明顯與胎鼠和新生鼠不同。在表達(dá)Nodal蛋白的器官中，腎既表達(dá)ALK7-1又表達(dá)ALK4-1蛋白，并且還同時(shí)表達(dá)Cripto-1，大腦、小腦和肝只表達(dá)了ALK4-1，而脾僅同時(shí)表達(dá)ALK7-1蛋白。其余不表達(dá)Nodal蛋白的9種組織器官中，大腸、小腸、胃、膀胱、骨骼肌和心臟均有受體ALK7-1蛋白達(dá)。

圖3 Nodal及其受體在仔鼠組織器官中的表達(dá)分布

2.4Nodal及其受體在成年鼠組織器官中的表達(dá)分布 4個(gè)時(shí)期的小鼠組織器官中，成年鼠檢測(cè)的器官數(shù)量最多，并且表達(dá)模式也最豐富，特別是在檢測(cè)的所有器官中均有較強(qiáng)的ALK7-1蛋白表達(dá)(圖4)。在選取的20種成年鼠組織器官中，肝、大腦、小腦、脊髓、睪丸、肺、乳腺、脾、胃、大腸、腎、心和前列腺等13種器官有不同程度的Nodal蛋白表達(dá)。以表達(dá)成熟Nodal蛋白為主，特別在腎和心臟兩種器官中高表達(dá)成熟Nodal蛋白。在表達(dá)Nodal蛋白的組織器官中，肝、小腦和脊髓同時(shí)表達(dá)了ALK7-1和ALK4-1及Cripto-1蛋白。大腦、睪丸、肺、乳腺、脾、胃、大腸、腎、心和前列腺等10種表達(dá)Nodal的器官同時(shí)也表達(dá)了ALK7-1蛋白，大部分組織器官還表達(dá)了Cripto-1蛋白，均未檢測(cè)ALK4-1表達(dá)。不僅所有成年鼠組織器官表達(dá)ALK7-1，而且ALK7的其他剪接異構(gòu)體也在這些器官中有較強(qiáng)表達(dá)。但是僅有肝、胰、小腦和脊髓等4種組織器官表達(dá)ALK4的剪接異構(gòu)體，這明顯與前面3個(gè)時(shí)期的表達(dá)模式不同。

圖4 Nodal及其受體在成年鼠組織器官中的表達(dá)分布

3 討 論

現(xiàn)有研究已知Nodal分子在早期胚胎發(fā)育和體軸左右不對(duì)稱(chēng)形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3,6]，但是Nodal分子在個(gè)體發(fā)育后期中是否發(fā)揮作用并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究檢測(cè)了Nodal及其受體蛋白在小鼠個(gè)體發(fā)育后期的4個(gè)不同時(shí)期中的表達(dá)情況，以提示其可能具有的功能。結(jié)合4個(gè)發(fā)育時(shí)期的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Nodal蛋白在4個(gè)時(shí)期的大腦、小腦、肝、腎等4種組織器官中均有表達(dá)；由于受個(gè)體太小的限制，未檢測(cè)胎鼠脾臟中Nodal蛋白，不過(guò)在新生鼠、仔鼠和成年鼠3個(gè)時(shí)期的脾臟中均檢測(cè)到Nodal蛋白；此外，除胎鼠肺中未檢測(cè)到Nodal蛋白外，在新生鼠、仔鼠和成年鼠3個(gè)時(shí)期的肺中均檢測(cè)到Nodal蛋白。如果再結(jié)合Nodal受體的表達(dá)進(jìn)行分析，僅僅只有肝和腎這兩種器官是既有Nodal分子表達(dá)又有受體ALK7-1和(或)ALK4-1，以及輔助受體Cripo-1蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示在已檢測(cè)的多種器官中，Nodal信號(hào)通路可能對(duì)小鼠肝和腎的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有一定作用。在大腦、小腦、脾和肺等4種器官發(fā)育過(guò)程中均有Nodal蛋白表達(dá)，但未檢測(cè)到其受體ALK7-1和(或)ALK4-1蛋白表達(dá)，這有可能Nodal分子通過(guò)ALK7或ALK4的其他剪接異構(gòu)體或者通過(guò)其他未知Nodal受體起作用。此外，只有胰腺和骨骼肌這兩種被檢測(cè)的器官是在較早期的胎鼠和新生鼠階段有Nodal蛋白表達(dá)，而在后期的仔鼠和成年鼠階段卻不表達(dá)。

關(guān)于Nodal及其受體在胚胎發(fā)育過(guò)程中表達(dá)與功能研究的文獻(xiàn)較多，但是未檢索到Nodal及其受體在個(gè)體發(fā)育后期至成年之前時(shí)基因表達(dá)和功能研究的文獻(xiàn)，不過(guò)已有少量文獻(xiàn)報(bào)道了Nodal及其受體在成年動(dòng)物中表達(dá)。ZHAO等[11]發(fā)現(xiàn)Nodal在草魚(yú)的垂體、大腦、心、腎和脾等組織器官中有少量mRNA表達(dá)，而在生殖腺細(xì)胞中有較強(qiáng)表達(dá)。Nodal及其受體還在小鼠的乳腺上皮細(xì)胞、睪丸雄性生殖細(xì)胞[12-15]，以及成年人的胰島和子宮內(nèi)膜中有表達(dá)[16-18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)成年鼠組織器官中均有Nodal及其受體蛋白的表達(dá)。這不僅印證和進(jìn)一步豐富了現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)，也提示Nodal可能并不適宜作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。因?yàn)樽罱延形墨I(xiàn)報(bào)道Nodal在惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[9]，甚至已開(kāi)發(fā)出單克隆抗體進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)[19]。但是如果在人正常組織中存在Nodal表達(dá)，針對(duì)Nodal分子的單克隆抗體治療很可能會(huì)影響正常組織器官的功能。HOOIJKAAS等[10]報(bào)道Nodal蛋白在健康人腎臟組織中有較強(qiáng)表達(dá)，本研究也發(fā)現(xiàn)在所有檢測(cè)的成年鼠組織器官中腎臟有最強(qiáng)的Nodal蛋白表達(dá)。

本研究除檢測(cè)到已知作為Nodal分子受體的ALK7-1和ALK4-1蛋白表達(dá)外，還在不同發(fā)育時(shí)期和不同組織器官中不同程度地檢測(cè)到ALK7和ALK4功能未知的其他剪接異構(gòu)蛋白表達(dá)。提示ALK7和ALK4的這些剪接異構(gòu)蛋白應(yīng)該在相應(yīng)的小鼠組織器官具有一定功能，具體功能有待進(jìn)一步探索。另一有趣現(xiàn)象是發(fā)現(xiàn)胎鼠和新生鼠檢測(cè)到的Nodal蛋白均為前體形式，而仔鼠和成年鼠的多種組織器官中僅檢測(cè)到成熟Nodal蛋白。成熟Nodal一般不穩(wěn)定，為什么會(huì)在這些組織器官中被大量檢測(cè)到還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，Nodal分子在小鼠個(gè)體發(fā)育后期4個(gè)階段的多種組織器官中有較強(qiáng)表達(dá)，特別是在成年鼠的大部分組織器官中均存在不同程度表達(dá)，提示Nodal分子可能并不適合作為腫瘤免疫治療的靶點(diǎn)。Nodal及其受體在小鼠個(gè)體發(fā)育4個(gè)不同階段的肝和腎臟中均有表達(dá)，提示Nodal信號(hào)可能對(duì)這兩種器官的生長(zhǎng)發(fā)育有一定作用。此外，在大多數(shù)成年鼠組織器官中有完整的Nodal信號(hào)通路，說(shuō)明Nodal信號(hào)對(duì)維持這些器官的功能活動(dòng)應(yīng)有相應(yīng)作用。因此，有必要在后續(xù)研究中進(jìn)一步探究Nodal信號(hào)在維持個(gè)體發(fā)育和成年鼠組織器官中發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

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