逍遙抗癌解郁方對乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠海馬神經(jīng)元突觸后致密蛋白95表達的影響

韓遠山　金獅　王宇紅　孟盼　黃會珍　楊琴　趙洪慶　楊蕙　易剛強

摘要：目的 ?觀察逍遙抗癌解郁方對乳腺癌并發(fā)抑郁癥（BCRD）小鼠海馬神經(jīng)元突觸后致密蛋白95（PSD95）的影響，探討其對海馬組織的可能保護機制。方法 ?腋下注射4T1炎性乳腺癌細胞聯(lián)合背部皮下注射皮質(zhì)酮建立BCRD小鼠模型。隨機分為模型組、紫杉醇組、紫杉醇+氟西汀組、逍遙抗癌解郁方組、紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組，另取未造模BALB/c小鼠作為正常組。采用懸尾實驗和強迫游泳實驗檢測小鼠抑郁樣行為，HE染色觀察小鼠海馬和乳腺腫瘤病理變化，免疫組化染色和Western blot檢測小鼠海馬PSD95的表達。結(jié)果 ?與正常組比較，模型組小鼠懸尾實驗、強迫游泳實驗不動時間顯著增加（P<0.01），海馬結(jié)構(gòu)損傷明顯，PSD95表達水平顯著降低（P<0.01）;給予逍遙抗癌解郁方干預(yù)后，模型小鼠懸尾實驗、強迫游泳實驗不動時間明顯減少（P<0.05），海馬結(jié)構(gòu)損傷得以恢復(fù)，PSD95表達顯著升高（P<0.01），聯(lián)合紫杉醇出現(xiàn)腫瘤細胞大面積壞死。結(jié)論 ?逍遙抗癌解郁方可改善BCRD小鼠抑郁癥狀，有效輔助化療藥物抑制乳腺腫瘤增殖，并通過上調(diào)突觸可塑性相關(guān)蛋白PSD95的表達，保護海馬組織。

關(guān)鍵詞：逍遙抗癌解郁方;海馬;突觸后致密蛋白95;乳腺癌并發(fā)抑郁癥;小鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）09-0043-05

Effect of Xiaoyao Kangai Jieyu?Prescription on Hippocampal Neuron?Postsynaptic Density Protein 95?Expression in Mice with Breast Cancer Related Depression

HAN Yuanshan¹， JIN Shi²， WANG Yuhong^2，3， MENG Pan^2，3， HUANG Huizhen²， YANG Qin¹，ZHAO Hongqing^2，3， YANG Hui¹， YI Gangqiang¹

1. Central Laboratory， First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China; 2. Hunan Key Laboratory of Power and Innovative Drugs State Key Laboratory of Ministry Training Bases， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 3. Technology Innovation Center， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Objective?To study the effect of?regulation of Xiaoyao Kangai Jieyu?Prescription on hippocampal neuron postsynaptic density protein 95 （PSD95）?in mice with breast cancer related depression， and to?elucidate its possible?mechanism of protect hippocampus. Methods The BCRD mice model was established by axillary?injection of 4T1 inflammatory breast cancer cells combined with subcutaneous injection of corticosterone in the back and randomly divided into model group， paclitaxel group， paclitaxel + fluoxetine group， Xiaoyao Kangai Jieyu?Prescription group， paclitaxel + Xiaoyao Kangai Jieyu?Prescription group. Another unmodeled BALB/c mice were taken as the normal group. Detection of depression-like behavior?in mice with tail suspension test and forced swimming test.?The pathological structurre?changes of hippocampus and breast tumors were observed by HEstaining. The expression of PSD95 in hippocampus of mice was detected by immunohistochemical staining and Western?blot. Results Compared with the normal group， the immobility time in the tail suspension test and forced swimming test of the model group significantly increased （P<0.01）， the hippocampal formation was significantly damaged， and the expression level of PSD95 significantly decreased （P<0.01）. After the intervention of Xiaoyao Kangai Jieyu?Prescription， the immobility time of the model mice?obviously reduced?in the tail suspension test and forced swimming test （P<0.05）， the hippocampal structural damage was restored， and the expression level of PSD95 significantly increased （P<0.01）. Combined with paclitaxel， large areas of tumor cell necrosis could be observed.?Conclusion?Xiaoyao Kangai Jieyu?Prescription can improve the depressive symptoms of BCRD mice， effectively assist chemotherapy drugs to inhibit breast tumor proliferation， and protect hippocampus by up-regulating the expression of synaptic plasticity related protein PSD95.

Keywords：Xiaoyao Kang'ai Jieyu Prescription;?hippocampus; PSD95; breast cancer related depression; mice

乳腺癌患者診療過程中承受著巨大的心理壓力，對未來的不確定性和身體形象的擔(dān)憂易誘發(fā)精神疾病的產(chǎn)生，抑郁癥是乳腺癌患者最常見的并發(fā)癥^[1]。臨床研究表明，乳腺癌患者抑郁癥發(fā)生率達10%～25%^[2]，嚴重影響乳腺癌治療和預(yù)后過程^[3]。因此，研究乳腺癌并發(fā)抑郁癥發(fā)病機制并進行藥物干預(yù)意義重大。研究表明，乳腺癌患者存在下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能亢進^[4]。HPA軸功能障礙，糖皮質(zhì)激素代謝紊亂，導(dǎo)致包括神經(jīng)元損傷、神經(jīng)營養(yǎng)低下和神經(jīng)再生障礙在內(nèi)的海馬病理結(jié)構(gòu)改變，是抑郁癥發(fā)生的重要神經(jīng)生物學(xué)機制^[5]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠腫瘤標志物和HPA軸相關(guān)指標顯著升高，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)明顯降低，逍遙抗癌解郁方可有效改善抑郁樣指征，輔助紫杉醇延緩乳腺癌并發(fā)抑郁癥的發(fā)展^[6]。本實驗觀察逍遙抗癌解郁方對乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠海馬結(jié)構(gòu)及海馬神經(jīng)元突觸后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95）的影響，探討其對海馬組織的可能保護機制。

1 ?實驗材料

1.1 ?動物

SPF級BALB/c雌性小鼠60只，4～6周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2013-0004。飼養(yǎng)于溫度（24±2）℃、相對濕度50%～60%、明暗周期12 h/12 h環(huán)境，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。

1.2 ?藥物

逍遙抗癌解郁方（柴胡9 g、夏枯草15 g、菟絲子9 g、枸杞子9 g、重樓9 g、姜黃9 g、人參6 g、貫葉連翹3 g等），飲片均購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并由該院制劑科按比例水煎濃縮;鹽酸氟西汀膠囊，法國Patheon，批號7705A;注射用紫杉醇脂質(zhì)體，深圳萬樂制藥有限公司，批號11807009。

1.3 ?主要試劑與儀器

兔抗鼠PSD95（英國Abcam公司），辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（武漢博士德公司），RIPA裂解液、BCA試劑盒（美國Thermo公司），DAB顯色液（北京索萊寶科技有限公司），RPMI培養(yǎng)基、雙抗、胰酶（美國HyClone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），PBS（北京中杉金橋公司），DMSO、二甲苯、伊紅、蘇木素、多聚甲醛、無水乙醇（上海藍潤公司）。TS-12A生物組織自動脫水機、BM-Ⅷ 生物組織包埋機、CS-Ⅵ攤片烤片機、冷凍臺（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），生物組織切片機（THERMO SCIENTIFIC），光學(xué)顯微鏡（ZEISS），Z32HK型高速冷凍離心（德國HERMLE），凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad）。

2 ?實驗方法

2.1 ?造模

參照課題組前期研究^[6]，以BALB/c小鼠為造模對象，在其腋下接種1×10⁷個/mL 4T1炎性乳腺癌細胞0.1 mL，制作乳腺癌小鼠模型，接種7 d后，觀察其是否成瘤，成瘤即表示造模成功。成模小鼠背部皮下注射皮質(zhì)酮（30 mg/kg）混懸液，連續(xù)21 d，懸尾實驗和強迫游泳實驗檢測抑郁癥模型是否建立成功，從而制作乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠模型。

2.2 ?分組和給藥

將篩選出的乳腺癌小鼠按自主活動隨機分為模型組、紫杉醇組、紫杉醇+氟西汀組、逍遙抗癌解郁方組和紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組，另取未造模BALB/c小鼠作為正常組，每組10只。小鼠于皮質(zhì)酮注射同時給藥。紫杉醇組每周腹腔注射1次紫杉醇脂質(zhì)體（20 mg/kg）;紫杉醇+氟西汀組給予紫杉醇脂質(zhì)體的同時每日灌胃鹽酸氟西汀（2.6 mg/kg）;逍遙抗癌解郁方組每日給予臨床等效劑量逍遙抗癌解郁方（19.5 g/kg）;紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組給予紫杉醇脂質(zhì)體的同時每日灌胃逍遙抗癌解郁方;正常組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，共21 d。末次皮質(zhì)酮注射完成后，進行懸尾實驗和強迫游泳實驗，完成后脫頸處死，取海馬、腫瘤組織，4 ℃冰箱保存待測。

2.3 ?懸尾實驗

小鼠禁食不禁水24 h后，將小鼠尾部部分固定在距離地面60 cm處，使其呈倒掛狀態(tài)，小鼠之間留有一定距離，并視線彼此隔離，適應(yīng)30 s后，記錄小鼠3 min內(nèi)四肢不動時間。

2.4 ?強迫游泳實驗

小鼠禁食不禁水24 h后，實驗用水缸要求視線隔離，水溫為室溫，水深要求小鼠自然漂浮狀態(tài)尾部無法接觸缸底，將小鼠頭朝下放入水缸中，適應(yīng)30 s后，記錄4 min內(nèi)小鼠不動時間。

2.5 ?海馬和乳腺腫瘤病理觀察

取固定于4%多聚甲醛溶液中海馬組織和乳腺腫瘤，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，封片，鏡下觀察。

2.6 ?免疫組化染色檢測海馬神經(jīng)元突觸后致密蛋白95表達

取固定于4%多聚甲醛溶液中海馬組織，石蠟包埋切片，脫蠟至水，3%H₂O₂滅活內(nèi)源性酶，熱抗原修復(fù)，封閉后加入兔抗小鼠PSD95一抗（稀釋比例1∶100），4 ℃濕盒過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育20 min，滴加SABC，室溫靜置20 min，DAB顯色，蒸餾水洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。鏡下觀察每張玻片上5個不重復(fù)視野中陽性細胞，拍照。細胞核呈藍色，陽性表達區(qū)域為棕黃色。

2.7 ?Western blot檢測神經(jīng)元突觸后致密蛋白95表達

取海馬組織，加入RIPA裂解液，勻漿后離心取上清液，BCA試劑盒測定蛋白含量。Western blot檢測乳腺癌并發(fā)抑郁癥海馬組織PSD95蛋白表達，采用Image J圖像分析軟件掃描各條帶，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白對應(yīng)灰度值的比值作為蛋白的相對表達量。

3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以x（—）±s表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布用方差分析，兩兩比較方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett's T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?懸尾實驗和強迫游泳實驗結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，紫杉醇+氟西汀組、逍遙抗癌解郁方組和紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），紫杉醇組強迫游泳不動時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見圖1。

4.2 ?乳腺腫瘤病理變化

模型組小鼠腫瘤細胞排列緊密，壞死少，核質(zhì)比大，核分裂現(xiàn)象較多，細胞大小形態(tài)不一，有較多血管充盈其中;與模型組比較，紫杉醇組、紫杉醇+氟西汀組、紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組小鼠腫瘤細胞出現(xiàn)大面積成片壞死，可見明顯的蛋白樣和細胞碎片，未壞死部分細胞排列疏松，間隙變大，核分裂現(xiàn)象變少。結(jié)果見圖2。

4.3 ?海馬組織病理變化

正常組海馬神經(jīng)元呈橢圓狀，神經(jīng)元胞體飽滿，胞質(zhì)豐富，細胞核大而圓，排列整齊有序，間隙正常，邊緣結(jié)構(gòu)清晰;模型組海馬神經(jīng)元出現(xiàn)萎縮，胞漿濃縮，有空泡樣改變，細胞核體積變小或消失，且出現(xiàn)一定程度的深染，甚至出現(xiàn)破裂狀態(tài);逍遙抗癌解郁方組和紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)恢復(fù)與紫杉醇組和紫杉醇+氟西汀組趨勢一致，細胞界限清楚，神經(jīng)元增多，細胞結(jié)構(gòu)層次分明，細胞核形態(tài)無明顯差異，只可見少量變性細胞。結(jié)果見圖3。

4.4 ?免疫組織化染色結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠海馬組織PSD95表達與積分光密度值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，紫杉醇+氟西汀組、逍遙抗癌解郁方組、紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組小鼠海馬組織PSD95表達與積分光密度值明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。結(jié)果見圖4、圖5。

4.5 ?Western blot檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組小鼠海馬組織PSD95表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，紫杉醇+氟西汀組、逍遙抗癌解郁方組和紫杉醇+逍遙抗癌解郁方組小鼠海馬組織PSD95表達均不同程度升高（P<0.01，P<0.05），與免疫組化結(jié)果相一致。結(jié)果見圖6。

5 ?討論

乳腺癌屬中醫(yī)學(xué)“乳巖”范疇，抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)“郁證”范疇，情志不暢為乳巖和郁證的共同發(fā)病因素。乳巖可并發(fā)郁證，郁證又可誘發(fā)乳巖加重其病情的進展。因此，乳腺癌并發(fā)抑郁癥屬中醫(yī)學(xué)“乳巖”合并“郁證”范疇，情志失調(diào)是其發(fā)病的主要因素，與肝、脾、腎、腦密切相關(guān)，其病機關(guān)鍵可用“虛、瘀、毒、郁”來概括。逍遙抗癌解郁方由《太平惠民和劑局方》之逍遙散加減，具有疏肝解郁、健脾補腎、化瘀解毒功效。

本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間顯著增加，提示模型組小鼠存在抑郁樣行為;給予逍遙抗癌解郁方干預(yù)后，模型小鼠懸尾實驗和強迫游泳實驗不動時間減少，抑郁癥狀得到改善。從乳腺腫瘤病理學(xué)檢查結(jié)果可知，逍遙抗癌解郁方可有效輔助化療藥物紫杉醇使腫瘤細胞大面積壞死，并抑制腫瘤增殖。

海馬在調(diào)節(jié)生理、認知和行為方面發(fā)揮重要作用，海馬功能障礙被認為是至關(guān)重要的抑郁癥發(fā)病機制^[7]。海馬突觸的結(jié)構(gòu)和分子組成介導(dǎo)其在學(xué)習(xí)和記憶中的核心作用^[8]。PSD95是突觸后膜的蛋白標志物，是突觸后膜上最豐富、最重要的骨架蛋白，主要存在于興奮性谷氨酸能突觸內(nèi)，同時也可作為突觸可塑性標志物，參與突觸形成與重建，在突觸可塑性、控制突觸傳遞、學(xué)習(xí)記憶等方面具有重要的功能意義，其表達下降意味著突觸可塑性損傷^[9]。Adeosun等^[10]研究發(fā)現(xiàn)，抑制突觸后蛋白PSD95但不抑制突觸前蛋白突觸素，會導(dǎo)致海馬突觸后傳遞功能障礙，從而出現(xiàn)認知功能障礙。Liu等^[11]研究表明，阿魏酸通過增加慢性不可預(yù)測輕度應(yīng)激抑郁小鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子相關(guān)的突觸蛋白水平發(fā)揮抗抑郁作用，在前額皮質(zhì)和海馬中PSD95表達顯著上調(diào)。本研究中，與正常組比較，模型組小鼠海馬結(jié)構(gòu)損傷明顯，PSD95表達顯著降低，提示乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠海馬神經(jīng)元突觸可塑性顯著損傷;給予逍遙抗癌解郁方干預(yù)后，PSD95表達顯著升高，海馬結(jié)構(gòu)損傷得以恢復(fù)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，逍遙抗癌解郁方可改善乳腺癌并發(fā)抑郁癥小鼠的抑郁癥狀，有效輔助化療藥物抑制乳腺腫瘤增殖，并通過上調(diào)突觸可塑性相關(guān)蛋白PSD95的表達，保護海馬組織。

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