地塞米松對(duì)實(shí)驗(yàn)性蛛網(wǎng)膜下腔出血腦脊液中TGF-β1和軟腦膜厚度的影響

張坤 趙學(xué)明

[摘要] 目的 探討不同途徑早期給予地塞米松對(duì)TGF-β1濃度和軟腦膜纖維平均厚度的影響。 方法 通過(guò)枕大池給自體血建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，腹腔組及鞘內(nèi)組分別給予地塞米松。第20天時(shí)用ELISA法測(cè)腦脊液TGF-β1濃度，用圖像分析系統(tǒng)測(cè)軟腦膜纖維平均厚度。 結(jié)果 對(duì)照組中TGF-β1濃度及軟腦膜纖維平均厚度明顯高于腹腔給藥組和鞘內(nèi)給藥組；腹腔給藥組TGF-β1濃度及軟腦膜纖維平均厚度明顯高于鞘內(nèi)給藥組。 結(jié)論 SAH后早期靜脈給予大劑量地塞米松有可能對(duì)腦積水的發(fā)生有一定預(yù)防作用。

[關(guān)鍵詞] TGF-β1；軟腦膜纖維平均厚度；地塞米松

[中圖分類號(hào)] R743[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）12-0017-03

臨床上自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）屬于出血性腦血管病比較常見(jiàn)的現(xiàn)象，自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血是由于多種原因引起的腦血管破裂，使血液進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔所引起的綜合征，約占急性腦血管病的15%左右。臨床上影響蛛網(wǎng)膜下腔出血預(yù)后的主要因素為交通性腦積水及腦血管痙攣等，據(jù)報(bào)道，SAH繼發(fā)慢性腦積水的發(fā)生率為6%～67%，而其中15.0%～26.3%的患者需行腦室-腹腔分流術(shù)[1]。腦積水的發(fā)生給患者身心及經(jīng)濟(jì)上都帶來(lái)了二次負(fù)擔(dān)。繼發(fā)慢性腦積水的發(fā)生機(jī)制尚不明確。而相關(guān)研究表明轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）在SAH后腦積水形成中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)欲通過(guò)不同途徑早期給予地塞米松觀測(cè)其對(duì)TGF-β1濃度及軟腦膜纖維厚度的影響，進(jìn)而評(píng)定不同途徑給予地塞米松對(duì)慢性腦積水的預(yù)防效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

2011年9～11月進(jìn)行試驗(yàn)，選取由山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室提供的2～3月齡，體重250～350 g的雄性Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為枕大池給予地塞米松組（鞘內(nèi)給藥組）、腹腔給予地塞米松組（腹腔給藥組）、枕大池給予生理鹽水對(duì)照組（對(duì)照組）。在給藥后第20天時(shí)，分別檢測(cè)腦脊液中TGF-β1及軟腦膜纖維厚度的變化。

1.2 標(biāo)本制備

將實(shí)驗(yàn)大鼠稱重后，用10%的水合氯醛以0.3 mL/100 g給予腹腔注射麻醉，待角膜反射消失后，于后頸部及左側(cè)股動(dòng)脈區(qū)備皮，消毒左側(cè)股動(dòng)脈區(qū)，剪開(kāi)皮膚剝離股動(dòng)脈備用。然后將大鼠俯臥頭低位，消毒，取枕外隆凸以下正中切口約2.0 cm，鈍性分離頸部肌肉顯露環(huán)枕膜，用1 mL注射器針頭刺破環(huán)枕膜，有突破感后略推進(jìn)見(jiàn)有腦脊液流出。迅速抽取股動(dòng)脈動(dòng)脈血0.2 mL，推入枕大池。拔針后按壓3 min。俯臥頭低位約30 min。按不同組別分別給予腹腔注射地塞米松1 mg/100 g，鞘內(nèi)注射地塞米松0.2 mg/100 g，鞘內(nèi)注射生理鹽水0.2 mg/100 g，縫合切口。待麻醉清醒后入籠。72 h后取右側(cè)股動(dòng)脈重復(fù)上述操作。取樣前每日對(duì)切口消毒。

1.3 標(biāo)本取材

第20天時(shí)用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，取枕外隆凸以下原切口進(jìn)入，取腦脊液0.15～0.2 mL以2000 r/min離心20 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中待測(cè)。迅速將實(shí)驗(yàn)大鼠打胸，顯露心臟，經(jīng)左心室插管后，剪開(kāi)右心耳，用生理鹽水沖洗5 min后，灌注10%的甲醛30 min以固定，斷頭取腦后置于10%的甲醛中固定保存72 h后，石蠟包埋，每份標(biāo)本經(jīng)額、頂、枕部冠狀以5 μm切片。采用Masson三重染色。用山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室20×10倍光學(xué)顯微鏡下拍片，用圖像分析系統(tǒng)測(cè)軟腦膜纖維平均厚度。用ELISA法測(cè)腦脊液TGF-β1濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)應(yīng)用（x±s）表示，采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組之間的比較采用單因素方差分析，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腦脊液TGF-β1濃度與軟腦膜纖維厚度之間關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析法分析。

2 結(jié)果

對(duì)照組中TGF-β1濃度與軟腦膜纖維平均厚度明顯高于腹腔給藥組和鞘內(nèi)給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。腹腔給藥組TGF-β1濃度與軟腦膜纖維平均厚度明顯高于鞘內(nèi)給藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。通過(guò)相關(guān)性分析Pearson相關(guān)系數(shù)為0.949，P ＜ 0.01，故可以認(rèn)為T(mén)GF-β1濃度與軟腦膜纖維厚度呈直線正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

腦積水形成后患者可能發(fā)生神經(jīng)功能受損等嚴(yán)重影響生活質(zhì)量的癥狀，甚至直接危及生命中樞危害生命，因此對(duì)于腦積水的防治有著極其重要的意義。目前自發(fā)性SAH后形成慢性腦積水機(jī)制尚不明確，廣泛認(rèn)為SAH后在蛛網(wǎng)膜下腔的血細(xì)胞及其分解產(chǎn)物刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，部分出現(xiàn)過(guò)度修復(fù)，促進(jìn)膠原合成、沉積形成纖維化，引起腦膜廣泛粘連，使軟腦膜增厚，蛛網(wǎng)膜顆粒封閉最終導(dǎo)致腦脊液吸收障礙及循環(huán)持續(xù)受阻。Sajanti等[2]發(fā)現(xiàn)，SAH患者腦脊液中Ⅰ型原膠原和Ⅲ型原膠原明顯升高，它們是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，為絕大多數(shù)組織纖維化過(guò)程所需物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，大量研究表明TGF-β1在蛛網(wǎng)膜下腔出血后慢性腦積水的形成過(guò)程中起著主要作用。TGF-β1通過(guò)刺激膠原基因過(guò)度表達(dá)及其自分泌和旁分泌方式協(xié)調(diào)其他因子等多種機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，在纖維化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[3]。細(xì)胞外基質(zhì)主要成分為膠原，其中85%是Ⅰ型膠原。而TGF-β1對(duì)膠原蛋白產(chǎn)生的作用機(jī)制很復(fù)雜，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上，一方面在核因子的參與下，激活Ⅰ型膠原基因的啟動(dòng)子，進(jìn)一步通過(guò)報(bào)告基因而刺激膠原及纖維結(jié)合蛋白基因的表達(dá)，使膠原蛋白合成增加。另一方面，可通過(guò)抑制膠原酶表達(dá)、增加金屬蛋白酶等降解酶抑制因子的合成抑制其分解，從而達(dá)到抑制Ⅰ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的降解。正常人腦脊液中不含或含極少量TGF-β1，且表達(dá)程度極低。蛛網(wǎng)膜下腔出血后血小板、膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞、蛛網(wǎng)膜細(xì)胞和炎癥反應(yīng)等均可釋放大量的TGF-β1進(jìn)入腦脊液。Flood等[4]發(fā)現(xiàn)SAH后腦脊液中TGF-β1的濃度呈現(xiàn)兩個(gè)時(shí)相的升高，即早期的普遍表達(dá)和后期與損傷有關(guān)表達(dá)。在出血24 h后即出現(xiàn)第一時(shí)相的升高，估計(jì)與腦脊液中出現(xiàn)的大量的血小板釋放有關(guān)，后TGF-β1迅速降解。第二時(shí)相于SAH后第10天出現(xiàn)并持續(xù)高水平表達(dá)至第19天，預(yù)計(jì)與自身激活以自分泌釋放和各種刺激下激活血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放有關(guān)。TGF-β1是與組織纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子，其各組織間纖維化過(guò)程相近。在外周的研究中顯示如果TGF-β1持續(xù)過(guò)度增高就可引起組織纖維化，所以第二時(shí)相的持續(xù)高水平表達(dá)有可能與SAH后慢性腦積水的發(fā)生密切相關(guān)。TGF-β1除可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平刺激膠原蛋白過(guò)度沉積，還可促進(jìn)纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸等在細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，促進(jìn)纖維化。TGF-β1的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)軟腦膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致軟腦膜纖維增厚、蛛網(wǎng)膜下腔狹窄等病理過(guò)程，進(jìn)而引起正常的腦脊液通路受阻或吸收障礙引發(fā)腦水腫。Motohashi等還發(fā)現(xiàn)TGF-β1能促使軟腦膜細(xì)胞增殖，具有刺激腦脊液增多的作用[5]。

地塞米松作為腎上腺皮質(zhì)激素類藥有廣泛的抗炎及免疫抑制作用，具有減輕和防止組織對(duì)炎癥的反應(yīng)，能抑制膠原蛋白合成并促進(jìn)分解，抑制結(jié)締組織的增生，降低細(xì)胞壁和毛細(xì)血管壁的通透性，降低其炎性滲出。在基因水平的調(diào)節(jié)，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為糖皮質(zhì)類固醇激素的抗炎作用主要是通過(guò)與糖皮質(zhì)類固醇激素受體結(jié)合后增強(qiáng)抗炎基因或抑制炎癥基因的轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的[6]。地塞米松作為主要的抗纖維化藥物之一，廣泛應(yīng)用于抗外周纖維化疾病中而在中樞系統(tǒng)的應(yīng)用尚較局限。因TGF-β1在致纖維化的病理過(guò)程中為起主導(dǎo)作用的關(guān)鍵因子，從而推測(cè)地塞米松可能通過(guò)抑制TGF-β1途徑來(lái)防止纖維性疾病的進(jìn)展，從而能夠防止軟腦膜增厚。李彤等[7]研究發(fā)現(xiàn)地塞米松對(duì)SAH后蛛網(wǎng)膜下腔炎性反應(yīng)有抑制作用，且其抑制程度與藥物的局部濃度有關(guān)。相關(guān)研究顯示，在轉(zhuǎn)錄水平上地塞米松抗纖維化作用不僅表現(xiàn)為能直接抑制膠原基因的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄而且能拮抗TGF-β1的致纖維化作用[8]。根據(jù)許多文獻(xiàn)報(bào)道表明糖皮質(zhì)激素對(duì)已經(jīng)形成的纖維化作用不明顯。

目前大量相關(guān)研究顯示早期鞘內(nèi)給予地塞米松能有效防治腦積水，對(duì)于靜脈給藥預(yù)防腦積水卻鮮有報(bào)道。但是我們?cè)谂R床上對(duì)于SAH的患者往往存在禁忌或難以操作，尤其是對(duì)于動(dòng)脈瘤性SAH有誘發(fā)再次出血的可能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大劑量靜脈給予地塞米松有可能對(duì)于臨床上腦積水的預(yù)防有一定效果。但是大劑量應(yīng)用地塞米松有一定副作用。在Urbach的研究中，也發(fā)現(xiàn)引起鈣離子濃度下降的地塞米松的濃度為10-9 mol/L，和以往報(bào)道的＞10-4 mol/L不符[9]。這也許可以讓我們減少大劑量激素治療時(shí)所需的劑量，且仍可產(chǎn)生相同的作用效果，同時(shí)又可以減少副反應(yīng)的發(fā)生。當(dāng)然這有待于我們進(jìn)一步研究。