豬場(chǎng)蚊子中乙型腦炎病毒的ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)

魏燕鳴

摘要：收集湖北省與安徽省部分豬場(chǎng)的蚊子樣本，用ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)蚊子樣本是否攜帶有乙型腦炎病毒，并對(duì)豬群乙型腦炎病毒抗體進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，５３份蚊子樣品中乙型腦炎病毒陽(yáng)性樣品為４４份，表明這些豬場(chǎng)的蚊子廣泛攜帶有乙型腦炎病毒。從陽(yáng)性ＰＣＲ產(chǎn)物中隨機(jī)選出８?jìng)€(gè)，并將其克隆到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１載體中，得到５個(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒，進(jìn)行序列測(cè)定和進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明陽(yáng)性蚊子樣本攜帶的都是基因Ⅲ型乙型腦炎病毒。豬場(chǎng)的1 401份血清樣品的乙型腦炎病毒抗體陽(yáng)性率為57.7%，說明這些豬場(chǎng)豬群的乙型腦炎病毒感染率較高。

關(guān)鍵詞：豬場(chǎng)；蚊子；乙型腦炎病毒；ＲＴ－ＰＣＲ

中圖分類號(hào)：Ｓ８５２．６５＋９．６文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）14－3104-03

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｉｇ Ｆａｒｍｓ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ

ＷＥＩ Ｙａｎ－ｍｉｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｏｓｑｕｉｔｏ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ ｉｎ Ｈｕｂｅｉ ａｎｄ Ａｎｈｕｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＪＥＶ） ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ４４ ｏｕｔ ｏｆ ５３ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ， ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｎｇ ｔｈａｔ ＪＥＶ ｗａｓ ｗｉｄｅｌｙ ｃａｒｒｉｅｄ ｂｙ ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓ ｉｎ ｔｈｅｓｅ ｐｉｇ ｆａｒｍｓ． ８ ｏｆ ｔｈｅ ４４ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＡＳＹ－Ｔ１ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ； ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｓｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｇｅｎｏｔｙｐｅ Ⅲ ＪＥＶ． The positive rate of JEV in 1 401 serum samples in the pig farms was 57.7%， indicating a high infection rate of JEV in these farms.

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｇ ｆａｒｍｓ； ｍｏｓｑｕｉｔｏ； Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ； ＲＴ－ＰＣＲ

乙型腦炎病毒（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ，ＥＶ）屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種危害嚴(yán)重的人獸共患蟲媒性傳染病病原。該病毒具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒力，感染人后可以引起乙型腦炎。據(jù)估計(jì)，乙型腦炎全球每年平均發(fā)病５萬(wàn)例，死亡１．５萬(wàn)人，５７％～６８％的治愈者留有神經(jīng)學(xué)后遺癥［１］，其中嚴(yán)重者占１８％，約５０％病人有記憶缺損，３／４病人有運(yùn)動(dòng)失調(diào)和智力機(jī)能受損［２，３］。近年來，隨著人類活動(dòng)及全球氣候的變化，乙型腦炎的流行在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。同時(shí)，乙型腦炎也是危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一。

豬是乙型腦炎病毒的重要儲(chǔ)存宿主和擴(kuò)增宿主，也是乙型腦炎的主要傳染源［４］。一般情況下乙型腦炎病毒的感染呈豬—蚊—人鏈狀［５］。因此，通過監(jiān)測(cè)湖北省與安徽省部分豬場(chǎng)蚊子中乙型腦炎病毒的流行與分布情況，為豬場(chǎng)乙型腦炎臨床防控提供參考。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１蚊子樣品蚊子樣品于２００９年６月至８月采自湖北省和安徽省部分豬場(chǎng)。

１．１．２菌種與試劑菌株Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α、ｐＥＡＳＹ－Ｔ１載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司、所用限制性內(nèi)切酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、相應(yīng)的緩沖液、ＤＮＡ分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)ＤＬ ５ ０００購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；ＤＮＡ純化回收試劑盒Ｃｙｃｌｅ－Ｐｕｒｅ Ｋｉｔ、質(zhì)粒小提試劑盒Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ ＫｉｔⅠ購(gòu)自美國(guó)Ｏｍｅｇａ生物技術(shù)公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ α ＴＭ購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司，乙型腦炎乳膠凝集抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司。

１．１．３引物根據(jù)乙型腦炎病毒Ｅ蛋白基因序列設(shè)計(jì)并合成ＲＴ－ＰＣＲ所用的引物：Ｐ１：５′－ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＡＣＣ－３′；Ｐ２；５′－ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＴＣＡ ＣＣＡ ＡＡＣ－３′。擴(kuò)增的靶序列為４６７ ｂｐ。

１．２方法

１．２．１樣品總ＲＮＡ的提取將采集的豬場(chǎng)蚊蟲樣本用勻漿器研磨，制成懸液，反復(fù)凍融３次，以

３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ，?。玻埃?μＬ上清勻漿液，加入８００ μＬ的Ｔｒｉｚｏｌ細(xì)胞裂解液，振搖混勻，于室溫放置１０ ｍｉｎ；加入２００ μＬ氯仿，混合均勻，于室溫放置１０ ｍｉｎ后，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１５ ｍｉｎ；將上層溶液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入等體積的異丙醇，于室溫放置１０ ｍｉｎ，以１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ；棄去上清液，加入１ ｍＬ體積分?jǐn)?shù)為７５％的乙醇，洗滌沉淀，以８ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心５ ｍｉｎ；棄去上清，于室溫干燥５～１０ ｍｉｎ；加入２０～３０ μＬ ＤＥＰＣ水，溶解ＲＮＡ，直接用于反轉(zhuǎn)錄或保存于－８０ ℃冰箱備用。

１．２．２Ｅ蛋白基因的ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增２０.0 μＬ的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：總ＲＮＡ模板１０.0 μＬ，５×ＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ ４.0 μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ２.0 μＬ，Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ０．５μＬ，ＡＣＥ－α ０．５ μＬ，Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ０．５ μＬ，滅菌水２．５ μＬ。反應(yīng)條件：３０ ℃反應(yīng)１０ ｍｉｎ，４２ ℃反應(yīng)３０ ｍｉｎ，９９ ℃反應(yīng)５ ｍｉｎ。所得的ｃＤＮＡ保存于－８０ ℃冰箱備用。

２５.0 μＬ的ＰＣＲ擴(kuò)增體系如下：ｃＤＮＡ ３.0 μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ，１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ２．５ μＬ，上游引物０．５ μＬ，下游引物０．５ μＬ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ ０．５ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １７．５ μＬ。將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，反應(yīng)條件：９５ ℃預(yù)變性５ ｍｉｎ；９５ ℃變性４５ ｓ，５５ ℃退火４５ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸１０ ｍｉｎ。反應(yīng)結(jié)束后，?。场?μＬ ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

１．２．３重組質(zhì)粒的構(gòu)建ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)０．８％瓊脂糖凝膠電泳分離后，用ＤＮＡ片段膠回收試劑盒回收?；厥盏模校茫耶a(chǎn)物連接到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１載體中，轉(zhuǎn)化，然后篩選陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。

１．２．４重組質(zhì)粒插入片段的序列分析將篩選出的陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用ＤＮＡＳｔａｒ軟件分析，并與ＧｅｎＢａｎｋ中登錄的其他乙型腦炎病毒的Ｅ蛋白基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較和分析。

１．２．５豬群乙型腦炎病毒抗體的檢測(cè)從采集上述蚊子樣品的豬場(chǎng)中隨機(jī)采集豬血清１ ４０１份，然后利用乙型腦炎乳膠凝集抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)被檢血清進(jìn)行乙型腦炎病毒抗體的檢測(cè)。

２結(jié)果與分析

２．１蚊子樣品的RT-ＰＣＲ檢測(cè)結(jié)果

提取樣品的總ＲＮＡ后進(jìn)行ＲＴ－ＰＣＲ反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果如圖１。結(jié)果表明，從樣品中擴(kuò)增出了與預(yù)期片段大小相符的特異性片段，長(zhǎng)度為４６７ ｂｐ。５３份樣品中陽(yáng)性樣品有４４份，陽(yáng)性率達(dá)８３％，表明豬場(chǎng)蚊子攜帶乙型腦炎病毒的比例很高，豬感染乙型腦炎病毒的風(fēng)險(xiǎn)也很高。

２．２重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

純化回收隨機(jī)選取的８?jìng)€(gè)陽(yáng)性樣本的ＰＣＲ產(chǎn)物，連接到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１載體上，轉(zhuǎn)化后篩選獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，用Ｈｉｎ ｄＩＩＩ和Ｅｃｏ ＲⅤ雙酶切鑒定，分別得到了與預(yù)期目標(biāo)大小相符的２個(gè)片段，結(jié)果表明，目的片段連接、轉(zhuǎn)化正確。其中２個(gè)陽(yáng)性樣本的雙酶切結(jié)果見圖２。

２．３Ｅ蛋白基因片段的序列分析

將上述８?jìng)€(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序后，利用ＤＮＡｓｔａｒ軟件對(duì)序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，從命名為ＨＢ３Ｃ、ＨＢ２２Ｂ、ＨＢ３３Ａ、ＨＢ４１Ｂ、ＨＢ４８Ｂ的陽(yáng)性重組質(zhì)粒擴(kuò)增得到的５個(gè)插入序列的大小均為４６７ ｂｐ。同時(shí)，從網(wǎng)上下載了１1株乙型腦炎病毒的Ｅ蛋白基因序列。用ＤＮＡｓｔａｒ生物學(xué)分析軟件對(duì)這１6個(gè)乙型腦炎病毒Ｅ蛋白基因序列進(jìn)行同源性比較，繪制遺傳進(jìn)化樹（圖３）。結(jié)果表明，１6個(gè)乙型腦炎病毒Ｅ蛋白基因序列分別存在于兩個(gè)分支上，其中ＨＢ２２Ｂ與ＨＢ４８Ｂ的來源一致，與ＡＹ３７６４６１的遺傳距離較近。而樣本ＨＢ３Ｃ與ＨＢ３３Ａ的來源一致，ＨＢ４１Ｂ與網(wǎng)上選取的１1株乙型腦炎病毒的遺傳距離較近。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，５個(gè)陽(yáng)性蚊子樣本攜帶的均為基因Ⅲ型乙型腦炎病毒。

２．４乙型腦炎病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

乳膠凝集試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，在１ ４０１份臨床血清樣品中，乙型腦炎抗體陽(yáng)性樣品為８０８份，陽(yáng)性率為５７．７％。

３小結(jié)與討論

通過ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)方法檢測(cè)了２００９年在湖北省與安徽省兩省部分豬場(chǎng)采集的蚊蟲樣本中的乙型腦炎病毒Ｅ蛋白基因片段，陽(yáng)性檢出率達(dá)到了８３％。結(jié)果顯示，所選豬場(chǎng)蚊子普遍攜帶乙型腦炎病毒，鑒于蚊子在乙型腦炎病毒傳播中的中間宿主作用，所選豬場(chǎng)的豬群感染乙型腦炎病毒的風(fēng)險(xiǎn)較大。同時(shí)，為了進(jìn)一步查明這些豬場(chǎng)豬群的乙型腦炎病毒血清流行病學(xué)情況，還利用乳膠凝集試驗(yàn)對(duì)這些豬場(chǎng)的１ ４０１份血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明乙型腦炎病毒抗體陽(yáng)性率為５７．７％，說明這些豬場(chǎng)豬群的乙型腦炎病毒感染率較高。

有資料報(bào)道，乙型腦炎病毒分為４型，來自于泰國(guó)北部及柬埔寨地區(qū)的毒株屬于基因Ⅰ型；來自于泰國(guó)南部、馬來西亞、印度尼西亞的毒株屬于基因Ⅱ型；來自于日本、中國(guó)等地區(qū)的毒株屬于基因Ⅲ型；部分來自印度尼西亞的ＪＫＴ６４６８毒株獨(dú)自形成了基因Ⅳ型［６］。但是近十多年來，乙型腦炎病毒基因型的地域有了新的變化。如韓國(guó)和日本已經(jīng)報(bào)道發(fā)現(xiàn)基因Ⅰ型乙型腦炎病毒［７］。研究在進(jìn)行乙型腦炎病毒檢測(cè)的同時(shí)，隨機(jī)選取了８?jìng)€(gè)陽(yáng)性樣本，通過ＲＴ－ＰＣＲ擴(kuò)增出了乙型腦炎病毒Ｅ蛋白基因片段，并將Ｅ蛋白基因片段連接到ｐＥＡＳＹ－Ｔ１載體上，對(duì)得到的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，最后得到５個(gè)正確質(zhì)粒。用生物學(xué)分析軟件ＤＮＡｓｔａｒ?qū)模牵澹睿拢幔睿肷舷螺d的１1株其他乙型腦炎病毒的Ｅ蛋白基因序列以及５個(gè)正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了同源性比較和分析，并繪制了遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果表明，檢測(cè)的蚊子攜帶的乙型腦炎病毒均屬于基因Ⅲ型，說明在中國(guó)湖北、安徽兩省的基因Ⅲ型乙型腦炎病毒可能屬于主要基因型。

綜上所述，利用ＲＴ－ＰＣＲ方法對(duì)湖北、安徽兩省部分豬場(chǎng)蚊子攜帶乙型腦炎病毒的情況進(jìn)行了檢測(cè)，并利用乳膠凝集試驗(yàn)對(duì)這些地區(qū)豬群乙型腦炎病毒抗體進(jìn)行了評(píng)價(jià)，初步證實(shí)了湖北、安徽兩省豬場(chǎng)蚊子乙型腦炎病毒的攜帶率較高，豬群乙型腦炎病毒感染率也較高，從而為更深入闡明華中地區(qū)豬群乙型腦炎病毒的分子流行學(xué)與血清流行學(xué)規(guī)律打下了基礎(chǔ)。

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