葉綠素降解菌的篩選與應(yīng)用

陳志良,李海云,李子院,郝再彬

摘要：以葉綠素為培養(yǎng)基成分，在不添加無機鹽的條件下，從土壤中分離篩選得到一株能降解葉綠素的菌株；經(jīng)過形態(tài)學鑒定，確定它為曲霉屬中的一種，菌株命名為ＧＬＨＺＢ３１９，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心內(nèi)，保藏編號為ＣＣＴＣＣ Ｎｏ： Ｍ２０１１１０１。在溫度為３０ ℃、搖床轉(zhuǎn)速１００ ｒ／ｍｉｎ、自然ｐＨ、ＧＬＨＺＢ３１９菌株接種孢子量為１．０×１０６個／ｍＬ的培養(yǎng)條件下，把１００ ｍＬ的葉綠素水溶液培養(yǎng)３ ｄ，溶液的吸光度值由０．３１０降解到０．００２，降解率達到９９％。

關(guān)鍵詞：葉綠素；降解菌；篩選

中圖分類號：Ｑ９４５．１１；Ｑ９４８．１２＋２．３；Ｑ９３９．９７文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）14－2992-04

Screening and Application of Chlorophyll Degradation Bacterium

ＣＨＥＮ Ｚｈｉ－ｌｉａｎｇ，ＬＩ Ｈａｉ－ｙｕｎ，ＬＩ Ｚｉ－ｙｕａｎ，ＨＡＯ Ｚａｉ－ｂｉｎ

（Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｇｕｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Tｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００４，Ｇｕａｎｇｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔａｋｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ａｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， ａｎｄ ａｄｄｉｎｇ ｎｏ ｉｎｏｒｇａｎｉｃ， ａ ｓｔｒａｉｎ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｉｔ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．． Ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｎａｍｅｄ ＧＬＨＺＢ３１９， ａｎｄ ｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Cｏｌｌｅｃｔｓ ｎｕｍｂｅｒ： ＣＣＴＣＣ Ｎｏ： Ｍ２０１１１０１）． Ａｔ ３０ ℃， ｓｈａｋｉｎｇ ｓｐｅｅｄ １００ ｒ／ｍｉｎ， ｎａｔｕｒａｌ ｐＨ， ｗｉｔｈ ＧＬＨＺＢ３１９ ｎａｔｕｒａｌ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔｙ １.0×１０６ ｉｎｄ．／ｍＬ， ｔｈｅ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ １００ ｍＬ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ０．３１０ ｔｏ ０．００２ ａｆｔｅｒ ３ ｄ， ｗｉｔｈ ａ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ９９％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ； ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ； ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ

葉綠素廣泛存在于植物體內(nèi)及藻類、光合細菌中，分布的部位主要是內(nèi)囊體膜；葉綠素類型主要包括葉綠素ａ和葉綠素ｂ，其中葉綠素ａ占的比例較大，通常葉綠素ａ∶葉綠素ｂ＝３∶１，它們難溶于水，但能溶于乙醇、丙酮和石油醚等有機溶劑［１，２］。葉綠素是葉綠酸的二醇酯，是由葉綠酸（鎂卟啉衍生物、二元羧酸）的兩個羧基分別與甲醇（ＣＨ4Ｏ）和植醇（Ｃ２０Ｈ40Ｏ）發(fā)生酯化反應(yīng)所形成的，是對光、熱、酸等環(huán)境條件不穩(wěn)定的物質(zhì)［３－６］。葉綠素ａ和葉綠素ｂ在結(jié)構(gòu)上的差別僅在于第二吡咯環(huán)上的一個－ＣＨ３被－ＣＨＯ所取代［７，８］。

在植物界有７ ０００多種植物可供人類食用，在民間約有５ ０００種草藥用來治療日常的各種疾病，在中藥材中有４０％是由綠色植物提供?，F(xiàn)代食品和藥品的提取需要脫除葉綠素［９］，目前在工業(yè)生產(chǎn)上脫除葉綠素的方法主要有：①物理吸附法，包括大孔樹脂吸附法和活性炭吸附法；②化學氧化法，包括雙氧水氧化法或次氯酸鈉氧化法；不過這兩類方法都存在一定的局限性。而采用生物工程技術(shù)方法降解葉綠素是環(huán)境友好型的處理方法，是未來發(fā)展的方向［１０］。

試驗通過微生物培養(yǎng)，利用葉綠素為培養(yǎng)基成分，在未添加無機鹽的情況下，從土壤中分離出一株能夠降解葉綠素的菌株，經(jīng)顯微形態(tài)觀察分析，鑒定為曲霉屬（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．）［１１］，命名為ＧＬＨＺＢ３１９菌株，并保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心里，保藏編號ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ２０１１１０１。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１試劑與用品主要試劑如丙酮、碳酸鈣、葡萄糖、２０％甘油等都為化學純；瓊脂為食品級，馬鈴薯為市售；葉綠素為桂林理工大學化學與生物工程學院實驗室從中華獼猴桃（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｐｌａｎｃｈ）葉片里提?。郏保玻?；劍麻（Ｙｕｃｃａ ｇｌｏｒｉｏｓａ Ｌ．）麻絲由南寧劍麻集團提供。

１．１．２儀器主要有Ｃａｒｙ５０紫外可見光分光光度計﹙美國Ｖａｒｉａｎ公司﹚、ＳＷ－ＣＪ－１Ｆ超凈工作臺﹙蘇靜集團安泰公司﹚、Ｎｉｋｏｎ Ｅ２００型光學顯微鏡＋數(shù)碼顯微鏡系統(tǒng)﹙江南光電有限公司﹚、ＭＩＲ－２５４ 恒溫培養(yǎng)箱和ＤＨＧ－９４２０Ａ電熱恒溫鼓風干燥箱（上海比朗儀器有限公司）等。

１．１．３培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍ，ＰＤＡ）；篩選培養(yǎng)基（葉綠素平板培養(yǎng)基）為ＰＤＡ培養(yǎng)基＋葉綠素＋瓊脂。各培養(yǎng)基均在１×１０２ ｋＰａ下滅菌３０ ｍｉｎ。

１．１．４土壤表樣采集土壤樣品來源于桂林市區(qū)的七星公園、穿山公園、南溪山公園等公園內(nèi)的林下表土，采樣時先鏟去地表的覆蓋物，再鏟掉０．５ ｃｍ厚的表土，然后取土壤樣品。

１．２菌種篩選

分離試驗采取平板稀釋法［１３］，具體操作是稱取土樣１．００ ｇ，加入盛有２５ ｍＬ去離子水的三角瓶中，振蕩１ ｍｉｎ，使土樣均勻分散，配制成土壤懸浮液，靜置１５ ｍｉｎ后，吸取土壤懸浮液３～５滴，滴于葉綠素平板培養(yǎng)基上，用涂布環(huán)涂布均勻，于３０ ℃恒溫培養(yǎng)３～４ ｄ后檢查鑒定。對于能在平板上生長的菌株繼續(xù)純培養(yǎng)，待長出合適的單菌落后，挑取單菌落劃斜面并編號，繼續(xù)在３０ ℃培養(yǎng)３～４ ｄ。然后從斜面上挑取菌落在葉綠素水溶液中進行發(fā)酵，進一步篩選對降解葉綠素效果更好的菌株。

１．３方法

１．３．１孢子懸浮液的制備經(jīng)過葉綠素平板篩選，共計有１０株菌株能正常生長；再經(jīng)過水溶液發(fā)酵復(fù)篩后，最終確定了一個降解效果好、生長較快的菌株；將篩選得到的菌株接種至ＰＤＡ斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)２ ｄ，在無菌條件下用去離子水洗下孢子，再用８層紗布過濾除去菌絲，制成孢子懸浮液，并定容至１００ ｍＬ，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ ｈ后，用梯度稀釋平板計數(shù)法計算懸浮液中的孢子數(shù)量，每個稀釋梯度做３個平行，取平均值。

１．３．２菌株脫色能力測定采用相對值［５］表示葉綠素含量的變化。將含有葉綠素的水溶液采用Ｃａｒｙ５０紫外可見光分光光度計進行全波長掃描，找出最大吸收峰的位置，以此波長的吸光度值變化作為參考依據(jù)。在葉綠素水溶液中接入１ ｍＬ用梯度稀釋平板計數(shù)法計算出孢子數(shù)量的懸浮液，經(jīng)過３ ｄ的發(fā)酵，用Ｃａｒｙ５０紫外可見光分光光度計測定，計算脫色率（降解率），比較菌株的降解效果。脫色率＝ ［（Ａ０－Ａｔ）／Ａ０］×１００％。式中，Ａ０為脫色前的吸光度值，Ａｔ為脫色后的吸光度值［１４］。

１．３．３種屬鑒定對經(jīng)過葉綠素平板篩選、水溶液發(fā)酵復(fù)篩得到的降解效果好、生長較快的菌株，按照文獻［１５］、文獻［１６］的方法，在Ｎｉｋｏｎ Ｅ２００型光學顯微鏡＋數(shù)碼顯微鏡系統(tǒng)里進行形態(tài)觀察、分析，初步確定其分類地位。

１．３．４菌絲、孢子形態(tài)和菌落特征觀察采用載玻片濕室培養(yǎng)法對經(jīng)過葉綠素平板培養(yǎng)基篩選、水溶液發(fā)酵復(fù)篩得到的降解效果好、生長較快的菌株進行培養(yǎng)，在不破壞其自然生長狀態(tài)的前提下，直接在顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態(tài)和菌落特征。載玻片濕室培養(yǎng)法具體操作如下：①準備濕室，在培養(yǎng)皿底部鋪一張圓形濾紙片，濾紙片上依次放上“Ｕ”形載玻片擱架、載玻片、蓋玻片（２片），蓋上皿蓋，外用白紙包扎，高壓滅菌（１×１０２ ｋＰａ）２０ ｍｉｎ后，于ＤＨＧ－９４２０Ａ電熱恒溫鼓風干燥箱中６０ ℃干燥60 min，備用。②接種，用接種環(huán)將篩選得到的菌株接種到濕室的載玻片上，每張載玻片可接２點，接種時只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可（接種量不要多，以免培養(yǎng)后菌絲過于稠密而影響觀察）。③加培養(yǎng)基，用無菌細口滴管吸取少許熔化并冷卻至４５ ℃的葉綠素平板培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，葉綠素平板培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，直徑約為０．５ ｃｍ（滴加量一般以１／２小滴為宜），注意保持無菌操作。④加蓋玻片，在葉綠素平板培養(yǎng)基未徹底凝固前，用無菌鑷子將皿內(nèi)的蓋玻片蓋在瓊脂薄層上，用鑷子輕壓蓋玻片，使蓋玻片和載玻片之間的距離相當接近，但不能壓扁（蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此留有小縫隙，一是為了通氣，二是使各部分結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀察）。⑤倒保濕劑：每皿倒入約３ ｍＬ、２０％的無菌甘油，使皿內(nèi)濾紙完全濕潤，以保持皿內(nèi)濕度，蓋上皿蓋。制成載玻片濕室，于恒溫培養(yǎng)箱中３０ ℃培養(yǎng)５ ｄ。⑥觀察。將培養(yǎng)好的載玻片取出，置于顯微鏡下直接觀察。

１．４葉綠素降解應(yīng)用試驗

以ＰＤＡ培養(yǎng)基為底物，用發(fā)酵３ ｄ后的經(jīng)過葉綠素平板培養(yǎng)基篩選、水溶液發(fā)酵復(fù)篩得到的降解效果好、生長較快的菌株溶液處理南寧劍麻集團提供的未去除葉綠素的劍麻麻絲，以沒有用菌株液處理的未去除葉綠素的劍麻麻絲作為對照，然后在３０ ℃下１００ ｒ／ｍｉｎ振蕩培養(yǎng)２４ ｈ，用水洗凈后在顯微鏡下觀察麻絲表面葉綠素的降解效果。

２結(jié)果與分析

２．１平板計數(shù)結(jié)果

對經(jīng)過葉綠素平板篩選、水溶液發(fā)酵復(fù)篩得到的降解效果好、生長較快的菌株孢子懸浮液在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ ｈ后，用梯度稀釋平板計數(shù)法計算孢子數(shù)量，得到的試驗數(shù)據(jù)為１．０×１０６個／ｍＬ。

２．２分類地位確定

對篩選得到的降解效果好、生長較快菌株經(jīng)顯微形態(tài)觀察分析，鑒定為曲霉屬（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．），并命名為ＧＬＨＺＢ３１９菌株。將該菌株送中國典型培養(yǎng)物保藏中心（Ｃｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＣＴＣＣ）保藏，保藏編號ＣＣＴＣＣ Ｎｏ：Ｍ２０１１１０１。

２．３脫色能力測定以及菌株降解效果

采用Ｃａｒｙ５０紫外可見光分光光度計測定的葉綠素水溶液最大吸光度值結(jié)果見圖１。從圖１可見，含有葉綠素的水溶液最大吸收峰的位置分別是６７７、６３９、４２２ ｎｍ，由此選定６７７ ｎｍ為葉綠素的吸收波長。

ＧＬＨＺＢ３１９菌株降解效果見圖２。試驗證明，葉綠素水溶液中接入１ ｍＬ數(shù)量為１．０×１０６個/mL的ＧＬＨＺＢ３１９菌株孢子懸浮液，經(jīng)過３ ｄ的發(fā)酵，能將葉綠素水溶液的吸光度值從０．３１０降解到０．００２，降解率（脫色率）達到了９９％以上。

２．4菌絲、孢子形態(tài)和菌落特征

采用載玻片濕室培養(yǎng)法使ＧＬＨＺＢ３１９菌株在載玻片上自然生長，在不破壞其自然生長狀態(tài)的前提下，直接在顯微鏡下觀察菌絲、孢子形態(tài)和菌落特征，結(jié)果見圖３。由圖３Ａ、圖３Ｂ可見，ＧＬＨＺＢ３１９菌株在ＰＤＡ培養(yǎng)基上３０ ℃、培養(yǎng)５ ｄ后，菌落直徑可達６～７ ｃｍ；菌絲生長良好，為棉絮狀至絨毛狀；最初綠色，逐漸變?yōu)榛疑囵B(yǎng)基反面呈灰白色。由圖３Ｃ可看出，ＧＬＨＺＢ３１９菌株的孢子梗沒有分支，孢子梗頂端膨大為近似圓球狀；另外在生長過程中不產(chǎn)生次生小柄。由圖３Ｄ可見，它的分生孢子為串珠狀，集中在孢子梗的上半部，散開呈扇形生長。

２．5劍麻麻絲葉綠素降解應(yīng)用試驗

ＧＬＨＺＢ３１９菌株液處理未去除葉綠素的劍麻麻絲的降解試驗結(jié)果見圖４。圖４左邊為劍麻葉片中抽出的麻絲，表面附有大量的葉綠素；右邊為被ＧＬＨＺＢ３１９菌株作用后的麻絲。從圖４中可見，ＧＬＨＺＢ３１９菌株作用后的麻絲表面干凈，沒有葉綠素殘留，說明ＧＬＨＺＢ３１９菌株對葉綠素的降解作用是十分明顯的，具有在工業(yè)上應(yīng)用的價值。

３小結(jié)與討論

試驗從土壤中分離純化出１株高效降解葉綠素的曲霉屬（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｍｉｃｈ．ｅｘ Ｌｉｎｋ：Ｆｒ．）菌株，命名為ＧＬＨＺＢ３１９；該菌株能以葉綠素為營養(yǎng)底物進行生長，對葉綠素的降解率高。目前已有部分關(guān)于微生物脫色降解染料的研究報道［１７－２０］，但利用生物工程方式降解葉綠素的報道尚未出現(xiàn)。而在劍麻麻絲的工藝處理上，對葉綠素的脫色主要是采用雙氧水氧化法，但是雙氧水脫色對麻絲的纖維分子結(jié)構(gòu)有一定的破壞作用，會影響麻絲的強度；同時雙氧水有化學殘留，對高檔劍麻紡織品有較大的負面影響，而試驗得到的ＧＬＨＺＢ３１９菌株，對未去除葉綠素的劍麻麻絲的脫色作用十分明顯，具有在工業(yè)上應(yīng)用的價值，建議進行中間試驗，以進一步完善與深入探討ＧＬＨＺＢ３１９菌株的效用。

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