體外培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及影響因素

王正輝等

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞是一類從臍帶血中分離和培養(yǎng)的成體干細(xì)胞，具有高度自我更新和多向分化的潛能。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的這些特性，吸引了眾多國內(nèi)外學(xué)者的目光，目前，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植的臨床治療取得了一定進展。本文就臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的采集分離、純化及生物學(xué)特性及研究前景作一簡要綜述。

臍帶血是指胎兒娩出，臍帶結(jié)扎，殘留在臍帶和胎盤靠近胎兒段內(nèi)的血液。臍帶血中含有兩種干細(xì)胞：造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）。臍帶血造血干細(xì)胞異體移植后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的可能性極低[1]，它已應(yīng)用于臨床治療，主要用于治療造血系統(tǒng)疾?。ò籽?、惡性淋巴瘤、骨髓瘤）、糖尿病、肝臟疾病等。間充質(zhì)干細(xì)胞具有高度的自我更新和多向分化的潛能，這些特性近年來引起了國內(nèi)外眾多研究者的廣泛關(guān)注。Lee等[2]將冷藏0.1～5年的臍血單個核細(xì)胞培養(yǎng)3～5周，獲得貼壁的細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，并具有間充質(zhì)細(xì)胞的免疫表型，表明可以長期凍存保存臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。2000年，Erices[3]首次報道臍血中含有間充質(zhì)干細(xì)胞，其形態(tài)和免疫學(xué)表型和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似。Karen [4]認(rèn)為臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離成功的關(guān)鍵在于：①從臍血中采集分離時間不超過15h；②臍血的量不少于33ml；③單個核細(xì)胞量不少于1×108個。但臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離成功率低[5-6]，甚至有些學(xué)者認(rèn)為臍血中沒有間充質(zhì)干細(xì)胞[7-9]。且隨著胎齡的增加，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、生長活性及分離培養(yǎng)的成功率逐漸下降。

1影響臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)成功的因素

1.1 臍血的采集量：個體差異較大，與產(chǎn)婦分娩的方式、采集者操作水平等因素有關(guān)，臍血采集量越大、分離的成功率越高。

1.2采集到分離的時間：要求24h內(nèi)完成分離接種，時間越短分離培養(yǎng)的成功率越高。

1.3 分離方法及培養(yǎng)條件的優(yōu)化：目前臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離，完全套用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法，這可能是導(dǎo)致臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離成功率低的重要原因之一。國內(nèi)外眾多學(xué)者對臍血間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，但由于條件的限制，尚無統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)，難以進行比較。

1.4首次接種密度：接種密度過大，細(xì)胞接觸抑制，生存空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分消耗過快；密度過低無法形成細(xì)胞生長所需的環(huán)境或者原代細(xì)胞發(fā)生老化。

1.5血清濃度：文獻報道血清濃度10%～20%，一般認(rèn)為低濃度血清更利于臍血間充質(zhì)干細(xì)胞生長，高濃度的血清含有大量促進細(xì)胞增殖的因子，細(xì)胞增殖迅速，容易過早發(fā)生老化。胎牛血清中異種蛋白隨臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植入人體后會增加細(xì)胞毒性反應(yīng)或者免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險。國內(nèi)有報道，通過從臍血中分離自體血清成功培養(yǎng)出臍血間充質(zhì)干細(xì)胞，可以大大降低免疫反應(yīng)；但自體血清量少，則難以支持臍血間充質(zhì)干細(xì)胞長期大量擴增。

1.6 細(xì)胞因子的使用：可以向純化后的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞中添加bFGF、EGF、GM-CSF、IL-3 等細(xì)胞因子[10]。

1.7 pH值：偏酸性的環(huán)境抑制造血干細(xì)胞及破骨樣細(xì)胞的生長，有利于臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的純化。

2臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法

2.1密度梯度離心法：為提高單個核細(xì)胞分離的成功率，目前多采用自然沉降與密度梯度離心相結(jié)合的方法。加速紅細(xì)胞沉降，可以向臍血中加入大分子物質(zhì)，如：明膠[12]、羥乙基淀粉、甲基纖維素等，也可以通過紅細(xì)胞裂解液氯化銨去除紅細(xì)胞。干細(xì)胞的密度與單個核細(xì)胞密度基本相同，在高速離心條件下通過分層液Ficoll或Percoll將單個核細(xì)胞從臍血中分離出來。該方法操作簡單，獲得的MSCs量可以滿足體外培養(yǎng)所需細(xì)胞密度要求。

2.2 貼壁培養(yǎng)法：體外培養(yǎng)的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞有貼壁生長的特性，但該方法提取的細(xì)胞純度不足，可有大量紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、破骨樣細(xì)胞等細(xì)胞成分。多次傳代后仍可見雜質(zhì)細(xì)胞，對間充質(zhì)干細(xì)胞增殖有一定影響。目前多主張將密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)方法相結(jié)合，可獲得較理想的分離效果。

2.3 免疫磁珠分選：表面包被抗體的磁珠與表面標(biāo)志抗原特異性結(jié)合，通過正選或負(fù)選將臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離出來。該方法對細(xì)胞活性影響較大。

2.4流式細(xì)胞儀分選：將干細(xì)胞大小和表面標(biāo)記進行分離，獲得的細(xì)胞純度高。免疫磁珠和流式細(xì)胞儀分選的方法，對臍血量要求大、抗體價格昂貴，對臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的活性影響較大，不適合實驗室推廣。

2.5 單細(xì)胞克隆方法：該方法技術(shù)要求較高，難以獲得大量的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞。

3臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞適合在偏酸性的環(huán)境中生長，目前常用的培養(yǎng)基有DMEM/F12、LG-DMEM、α-MEM、IMDM培養(yǎng)基。一般認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞專用Mesencult TM 培養(yǎng)基培養(yǎng)功率較高，但該培養(yǎng)基價格昂貴限制其廣泛地使用。如：Both 等[13]用α-MEM 培養(yǎng)基、低密度接種培養(yǎng)MSCs 優(yōu)于高密度下DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加地塞米松能促進細(xì)胞生長；Yang 等[14]采用含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基僅有23%的標(biāo)本成功培養(yǎng)出MSCs；Liu 等[15]以l×l07cells/cm2 接種密度于含有20%FBS 的IMDM 培養(yǎng)基中，結(jié)果144份臍帶血中有108份通過原代培養(yǎng)成功地培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，占總數(shù)的75%。加入人堿性成纖維細(xì)胞生長因子 bFGF、人表皮生長因子EGF、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子GM-CSF、 IL-3等細(xì)胞因子[16]對UCB-MSC的生長起促進作用。優(yōu)化培養(yǎng)可以使原代培養(yǎng)的成功率達(dá)到90%以上。目前認(rèn)為細(xì)胞因子作為蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)，通過結(jié)合與作用于受體的胞外域來激活細(xì)胞表面受體，并能夠識別與結(jié)合化學(xué)信號，觸發(fā)靶細(xì)胞產(chǎn)生特異的生理效應(yīng)。但這些細(xì)胞因子通過何種途徑進行細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其機制尚還沒有突破性研究。

4臍血間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

4.1形態(tài)學(xué)觀察：原代臍血間充質(zhì)干細(xì)胞初貼壁時呈圓形或橢圓形，散在分布，雙側(cè)伸出突起。折光性較強，突起伸長后呈現(xiàn)單個核的梭形。5～7天可見多個細(xì)胞相互聚集形成集落，原代細(xì)胞表現(xiàn)為異質(zhì)性可見梭形、多角形、不規(guī)則形狀。鏡下可以觀察到體積較大，多個核的破骨樣細(xì)胞，體積較小呈圓形的細(xì)胞，多個突起的、不規(guī)則形態(tài)的樹突狀細(xì)胞。3～4周后細(xì)胞生長至80%～90%融合時按1：3進行消化傳代。傳代后的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞4～6h開始貼壁，增殖迅速，1周左右可達(dá)到80%～90%融合。三代以后細(xì)胞形態(tài)均勻，梭形的細(xì)胞呈漩渦狀或者火焰狀生長。

4.2 免疫表型的鑒定：目前認(rèn)為MSCs表面抗原無特異性，既有間質(zhì)細(xì)胞，又有內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征。遲作華[17]總結(jié)了臍血間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)的主要分子包括：①粘附分子：CD54、CD51、CD44、CD13等；② 整合素家族成員：CD49b、CD49e、CD29等；③ 其他：CD90（Thy1）、SH2（CD105）、HLA-ABG、ASMA、SH13（CD166，ALCAM）、SH4（CD73）等。但不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志，如：CD45、CD34、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD38、CD133、CD135（FH-3）、CD117（e-kit）、glycophorin A等也不表達(dá)與人白細(xì)胞抗原（HLA）識別有關(guān)的共刺激分子B7-1、B7-2及主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子，如HLA-DR等。

5面臨問題

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離成功率低，培養(yǎng)周期長，難以建立穩(wěn)定純化的細(xì)胞系從而實現(xiàn)體外的大量擴增[18]；個體差異較大，尚無統(tǒng)一的體外分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)；缺乏特異的鑒定標(biāo)記，目前主要通過細(xì)胞的形態(tài)和非特異表型進行鑒定；定向誘導(dǎo)分化的方法和機制，以及分化后功能能否發(fā)揮及如何保持有待深入研究；細(xì)胞因子對細(xì)胞增殖分化的作用及相互之間存在的影響；確定HLA配型不符的最低標(biāo)準(zhǔn)，以擴大供體的來源；移植治療的最佳時機、劑量。相信隨著對臍血間充質(zhì)干細(xì)胞研究的深入，這些問題終將解決，使臍血間充質(zhì)干細(xì)胞更廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療。

[參考文獻]

[1]Zecca M，Prete A，Rondelli R，et al.Chronic graft-versus-host disease in children： incidence， risk factors， and impact on outcome[J].Blood，2002，100（4）：1192-1200.

[2]Lee MW，Choi J，Yang MS，et al.Mesenchymal stem cells from cryop reserved human umbilical cord blood [J]. Biochem Biophys Res Commun，2004，320（1）：273-278.

[3]EricesA，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymal p rogenitor cells in human umbilical cord blood [J].Br J Haematol，2000，109（1）：235-242.

[4]Bieback K，Kern S，Kluter H，et al.Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood[J].Stem Cells，2004，22（4）：625-634.

[5]Rosada C，Justesen J，Melsvik D，et al.The Human Umbilical Cord Blood： A Potential Source for Osteoblast Progenitor Cells[J].Calcified Tissue International，2003，72（2）：135-142.

[6]Kim JW，Kim SY，Park SY，et al.Mesenchymal progenitor cells in the human umbilical cord[J].Annals of Hematology，2004，83（12）：733-738.

[7]Mareschi K，Biasin E，Piacibello W，et al. Isolation of human mesenchymal stem cell：bone marrow versus umbilical cord blood[J].Haematologica，2001，86（10）：1099-1100.

[8]Wexler SA，Donaidson C，Denning-Kendall P，et al.Adult bone marrow is rich source of human mesenchymal 'stem'cells but umbilimal cord and mobilized adult blood are not[J].Br J Haematol，2003，121（2）：368-374.

[9]Yu M，Xiao Z，Shen L，et al.Mid-trimester feta； blood-derived adherent cells share characteristics similar to mesenchymal stem cells but full-term umbilical cord blood does not[J].Br J Haematol，2004，124（5）：666-675.

[10]Jang YK，Jung DH，Jung MH，et al.Mesenchymal stem cells feeder layer from human umbilical cord blood for ex vivo expanded growth and proliferation of hematopoietic progenitor cells[J].Ann Hematol，2006，85（5）：343-344.

[11]Tondreau T，Meuleman N，Delforge A，et al.Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized peripheral blood and cord blood：proliferation，OCT4 expression，and plasticity[J].Stem Cells，2005，23（8）：1105-1112.

[12]姚天華，湯曉雨，楊壯群，等. 體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的初步研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2007，16（4）： 450-454.

[13]Both SK，Van D，Muijsenberg AJ，et al A rapid and efficient method for expansion of human mesenchymal stem cells[J].Issue Eng，2007，13（1）：3-9.

[14]Yang SE，Ha CW，Jung M，et al.Mesenchymal stem/progenitor cells developed in cultures from UC blood[J]. Cytotherapy，2004，6（5）：476-486.

[15]Liu CH，Wu ML，Hwang SM.Optimization of serum free medium for cord blood mesenchymal stem cells[J]. Biochemical Engineering Journal，2007，33（1）：1-9.

[16]張積華，孫康，王妍，等.影響臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)（英文）[J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù)， 2011，15（14）：2653- 2656.

[17]遲作華，張洹.臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進展[J].國際生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2006，29（1）：29-34.

[18]Lee MW，Jang IK，Yoo KH，et al.Stem and progenitor cells in human umbilical cord blood[J].Inter J Hematol，2010，92（1）：45-51.

[收稿日期]2012-05-04 [修回日期]2012-06-25

編輯/李陽利