人重復性損傷性斑貼試驗評價化妝品安全性

仲少敏等

[摘要]目的：介紹人重復性損傷性斑貼試驗（HRIPT， Human Repeated Insult Patch Test）在化妝品安全性評估中的作用，并用該方法對11種化妝品的安全性進行評價。方法：在53名志愿者中對11種化妝品進行人重復性損傷性斑貼試驗，誘導期在后背部同一部位重復9次斑貼試驗；之后休息2周，在非斑貼部位皮膚進行激發(fā)試驗，斑貼24h、48h和72h后進行評分。試驗結果判讀參考國際接觸性皮炎研究組ICDRG評分標準。根據化妝品的性質分別選擇封閉或半封閉斑試器，0.3%～0.5%SLS作為陽性對照，凡士林和空白斑試器作為陰性對照。結果：11種受試化妝品中有7種顯示出輕度的刺激性，1名受試者在試驗前已對其中1種化妝品呈致敏狀態(tài)，11種測試產品均未出現誘導過敏反應。結論：人重復性損傷性斑貼試驗敏感性高，能夠明確區(qū)分刺激性、已致敏性和潛在致敏性，可以作為化妝品安全性的確證試驗。

[關鍵詞]人重復性損傷性斑貼試驗；皮膚刺激測試；接觸過敏；化妝品安全性

[中圖分類號]R758.22[文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2012）08-1342-04

隨著美容護膚品市場的不斷發(fā)展，新的化妝品和美容護膚手段層出不窮，化妝品不良反應及化妝品皮膚病的發(fā)生幾率也逐年增加。國家成立了專門的監(jiān)督管理機構和診斷機構對化妝品不良反應進行監(jiān)測，并同時加強對新研發(fā)化妝品上市前安全性的評估。對一種化妝品的安全性評估主要評價其是否具有使皮膚致敏和引起過敏性接觸性皮炎的可能性。目前評價的方法包括對產品組分結構特性的分析、文獻回顧、動物局部淋巴結試驗（LLNA）和人體試驗等。其中，人重復性損傷性斑貼試驗（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）被認為是證明產品不會在人體產生不良反應的最可信方法[1]，用于對動物實驗中已經判定為無明顯不良反應水平（NOEL）的物質的確證試驗[2]。目前國內很少有報道采用HRIPT進行化妝品安全性評估。本文介紹了筆者科室近期進行的一項針對常見刺激物及11種受試產品的HRIPT試驗，對如何進行HRIPT試驗和結果判讀進行闡述。

1材料和方法

1.1實驗對象：53名健康自愿受試者，其中男性6名，女性47名。受試者年齡為23～53歲（平均為34.7歲）。排除標準：①處于懷孕期、哺乳期或分娩半年內；②患有可能干擾試驗結果或增加受試者研究參加風險的急性或慢性疾??；③正在口服或外用可能干擾試驗結果的藥物（如糖皮質激素、非甾體類消炎藥、抗組胺類藥物和免疫抑制劑等）；④患有慢性過敏性皮膚病或近12個月內被診斷為皮膚腫瘤并接受治療者；⑤在斑貼部位有日曬傷、皮膚顏色不均勻、文身、痤瘡、濕疹、牛皮癬、瘢痕及其他可能會影響觀察的皮膚病受試者；⑥試驗經過北京大學第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2試驗材料

1.2.2斑試器：封閉式斑試器：為貼附于封閉式膠帶上的8mm鋁制小碟（北京大學醫(yī)學部醫(yī)學儀器公司）；半封閉斑試器：為直徑23mm的圓形防過敏膠帶（Curad Sensitive Skin ， Beiersdorf Inc.， Wilton CT）。

1.3試驗流程[3]： 整個試驗過程分為誘導期（3周），休息期（2周）和激發(fā)期（1周）三部分，持續(xù)時間為6周。試驗過程如圖1所示。

1.3.1誘導期：將加有受試物的斑試器用無刺激膠帶貼敷于受試者的脊柱右側，用手掌輕壓以使之均勻地貼敷于皮膚上，并用標記筆標記斑貼部位，保證誘導階段9次每個產品都是貼在相同的部位（每周一、三、五進行），如圖2所示。持續(xù)24h后，囑受試者將斑試器取下，避免搓洗局部。再間隔24h后（即下次斑貼之前，周五斑貼的為間隔48h）觀察反應。以上步驟共重復9次，持續(xù)時間為3周。

1.3.2 休息期：在誘導期結束后休息10～14天，期間無任何處理。

2結果

2.1結果判讀：HRIPT的結果是根據受試者在誘導期和激發(fā)期的皮膚反應綜合判定的。如受試者在某個樣品點上誘導期早期即發(fā)生紅斑、水腫、丘疹等反應，并在激發(fā)期再次出現同樣等級的反應，表明該受試者在試驗前已被該樣品致敏，記為前致敏狀態(tài)（Pre-sensitization）。如果在誘導期出現輕度反應（1～2分），而激發(fā)期未再現，為該樣品重復刺激造成的刺激反應（Irritation）；如果受試者在激發(fā)期的反應較誘導期明顯增強，表示該樣品在試驗期間誘導出這位受試者的過敏反應，提示這種產品具有潛在致敏性，記為誘導過敏（Induction of Sensitization） [5]。

Henderson 和Riley 對HRIPT的結果進行過統計學推算，假設在樣本量為100的人群中進行HRIPT檢測，如果結果為陰性，那么在同樣情況下使用這些產品時，在人群中產生過敏反應的幾率最大不會超過2.9%[2]。需要注意的是，因為HRIPT是在增加濃度和封閉的情況下測試，實際使用時過敏率更低，根據Hall等[6]的估計，化妝品誘導出皮膚過敏的概率約為0.09%。因此，HRIPT的陰性結果可以作為確證實驗來證實化妝品的安全性。

3討論

人重復性損傷性斑貼試驗（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）自1944年被Schwartz和Peck提出以后，經過不斷的改良，目前已經被認為是評價新材料或消費品對人體致敏性和刺激性的最可信方法。HRIPT在歐美的使用率是最高的，經濟與合作發(fā)展組織（OECD）和EU試驗指南中這兩種試驗也是優(yōu)選的方法，并可以在其他方法獲得數據不足的時候作為確證試驗[2]。HRIPT具有封閉性，可以模擬并放大人體實際使用過程，現已證實封閉式試驗優(yōu)于皮內注射和開放式局部應用的方法，具有足夠的敏感性，能檢測出絕大部分的致敏物[7-8]。

HRIPT在誘導期，每次斑貼持續(xù)24h，然后間隔24h或48h讀結果，并進行下一次斑貼，可以使前一次斑貼造成的皮膚反應充分顯現。誘導期結束后2周的休息期則使得各種免疫反應可以充分進行，并且此時誘導期的過敏反應通常都已消失，不會對激發(fā)期產生干擾。所用檢測物的濃度設定通常建議采用不引起刺激的最高濃度，這個濃度是從之前人體刺激性試驗、過敏原測試和人體重復應用試驗中的數據中獲得，有時還需要結合試驗設計考慮，如對實際應用中濃度放大數倍或者參照誤用后濃度進行檢測。通過采取劑量依賴性研究甚至可以了解通過減少劑量是否能達到安全的使用量，即反應誘發(fā)閾值（response elicitation threshold）[9]。這些特點都使得HRIPT具有更高的敏感性。在本研究中，11種產品在激發(fā)期都沒有出現陽性反應，但在誘導期有1～9人對5種樣品1、4、5、7、12、13和14中出現輕度紅斑反應，提示在實際使用過程中，重復外用這幾種化妝品可能具有一定的刺激性。但這個結果只有通過HRIPT才能夠發(fā)現，因為傳統的斑貼試驗是單次試驗結果判讀，就會得到類似誘導期的陰性結果。再次證明HRIPT的敏感性和在化妝品安全性檢測中的重要意義。

斑貼試驗的結果受到諸多因素的影響，如稀釋受試樣品的基質、樣品濃度、所用樣品的量、封閉方式等都可能影響，產生假陽性或假陰性的結果[10-11]。通常情況下，對于乳液、爽膚水等可在皮膚上長期駐留的產品可以選擇用未經稀釋的原液進行斑貼。而對于潔面乳這種洗脫類產品，由于在實際使用中會被大量的水沖洗掉，選擇用蒸餾水進行稀釋，用1%的稀釋液進行斑貼。即使這一濃度也大于實際使用中人體對這種化妝品的暴露濃度[12]。此外，封閉式斑試器也起到對受試樣品暴露的放大作用。而對于卸妝乳，其油溶性成分含量較高，通過以油溶油的原理去除彩妝，本身性質比較溫和，某些按摩油本身也具有卸妝的作用，可以在面部長期駐留。因此需要根據產品本身的性質判斷濃度和斑貼方式。本研究中有3種卸妝乳，考慮到放大效應，對3、5號選擇了封閉式斑貼，11號因為含有較多量表面活性劑，與12～14號潔面乳一樣選擇了半封閉斑試器進行試驗。結果只有5號有輕度的刺激反應，無過敏反應出現，說明在實際應用中是很安全的。

在進行多樣品斑貼試驗時還需要注意激動皮膚綜合征（excited skin syndrome）， 是由于皮膚對于某個樣品包括對于斑貼所用的膠帶等產生的強烈反應，可能會誘導出高激惹狀態(tài)（俗稱“激惹的后背”），從而使得其他樣品也出現輕度的陽性反應[13]。在本研究中，我們觀察到一些受試者對試驗用的膠帶或陽性對照產生比較強烈的反應，同時多個其他樣品點也表現為輕度紅斑反應，可能也受到了激動皮膚綜合征的影響，對于膠帶或陽性對照的強陽性反應也可能增加了樣品刺激反應率。

總之，HRIPT 通過采用延長暴露時間，采用較高使用濃度和封閉斑貼的方法，達到一種比實際使用時的放大效果，并可以檢測出極微弱的刺激反應，提示在實際使用時可能出現的風險。HRIPT的陰性結果可以證明人體不會對特定產品或配方產生不良反應。盡管如此，需要注意的是：出于倫理方面的考慮，HRIPT試驗并不用于預測或者篩選鑒定潛在的致敏原，而主要作為確證試驗，在放大應用的條件下來檢測配方中的過敏原，保證產品在面對消費者應用時的安全性[1-2]。

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[收稿日期]2012-04-09[修回日期]2012-06-12

編輯/李陽利