高濃度甲狀腺素對(duì)軟骨細(xì)胞聚集體（pellets）體外形成軟骨組織的作用

劉瑾春等

[摘要]目的：藥物濃度（100nM）甲狀腺素對(duì)組織工程軟骨形成的作用。方法：將軟骨細(xì)胞聚集體分為常規(guī)培養(yǎng)組（DMED+10%FBS）和100nM甲狀腺素組（DMED+10% FBS +100nM甲狀腺素），體外培養(yǎng)1、2和3周取材進(jìn)行大體形態(tài)、組織學(xué)、二型膠原和十型膠原免疫組化染色和軟骨特異基因PCR分析。結(jié)果：100nM甲狀腺素組形成的軟骨細(xì)胞聚集體的體積和濕重均明顯低于常規(guī)培養(yǎng)組，甲苯胺蘭、二型膠原（ColⅡ）染色較常規(guī)培養(yǎng)組弱，軟骨細(xì)胞特異基因的表達(dá)水平與常規(guī)培養(yǎng)組相似，軟骨細(xì)胞肥大相關(guān)基因十型膠原（ColⅩ）及基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）的表達(dá)較對(duì)照組減弱，成骨方向分化相關(guān)基因（ColⅠ，Runx2）的表達(dá)與常規(guī)培養(yǎng)組相似。結(jié)論：高濃度甲狀腺素能夠抑制軟骨細(xì)胞肥大，但同時(shí)也抑制了軟骨細(xì)胞增殖和軟骨細(xì)胞基質(zhì)分泌。

[關(guān)鍵詞]甲狀腺素；軟骨組織工程；軟骨細(xì)胞；細(xì)胞外基質(zhì)；細(xì)胞聚集體

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼][文章編號(hào)]1008-6455（2012）08-1324-04

軟骨組織工程為軟骨缺損修復(fù)提供了一種新的治療方法[1]。軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程種子細(xì)胞的一個(gè)重要來(lái)源，目前應(yīng)用軟骨細(xì)胞為種子細(xì)胞在體內(nèi)外已經(jīng)能夠成功構(gòu)建出精確形狀的成熟軟骨組織[2-3]。但是體外構(gòu)建的組織工程軟骨的生化和力學(xué)質(zhì)量與生理軟骨仍具有一定的差距[4]。在目前軟骨細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)方案（主要為DMEM添加10%胎牛血清）基礎(chǔ)上尋找新的優(yōu)化成分是軟骨組織工程的課題之一。

1材料和方法

1.3 軟骨細(xì)胞pellets培養(yǎng)：第二代軟骨細(xì)胞（P2）聚集體（pellets）根據(jù)培養(yǎng)基的不同分為2組，常規(guī)組培養(yǎng)基：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素。100nM甲狀腺素組：低糖DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素，100nM甲狀腺素。體外外培養(yǎng)1周，2周，3周分別取材進(jìn)行大體、組織學(xué)及相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)。

1.4 組織學(xué)檢測(cè)：取材后將標(biāo)本放入4%多聚甲醛中固定24h，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切成5μm厚切片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色觀察細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺多糖（Glycosaminoglycan，GAG）分泌情況。應(yīng)用鼠抗II型膠原單克隆抗體（Sigma）檢測(cè)II型膠原表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量指標(biāo)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，所測(cè)數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)（Student's t-test）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05為具有顯著性差異，統(tǒng)計(jì)軟件包為SPSS Ver.16.0。

2結(jié)果

2.4 Col II和Col X免疫組化染色結(jié)果：兩組pellets在第3天以及第1，2，3周的縱切面Col II和Col X染色見(jiàn)圖4。第1周兩組開(kāi)始明顯表達(dá)Col II，在培養(yǎng)3周時(shí)常規(guī)培養(yǎng)組Col II染色略強(qiáng)于100nM甲狀腺素組。兩組在培養(yǎng)第3天起即有Col X表達(dá)，在培養(yǎng)的3周過(guò)程中兩組的ColX染色相當(dāng)。

3討論

本實(shí)驗(yàn)觀察了藥物濃度（100nM）甲狀腺素對(duì)于體外組織工程軟骨形成的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度的甲狀腺素能抑制軟骨細(xì)胞肥大以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)，但同時(shí)使形成的軟骨樣組織減小，細(xì)胞外基質(zhì)糖胺多糖和二型膠原的表達(dá)減少。

甲狀腺素是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)生長(zhǎng)板軟骨的生長(zhǎng)和骨骼成熟的重要系統(tǒng)內(nèi)分泌因子，甲狀腺素直接刺激生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和成熟[11]。研究顯示，甲狀腺素低下的小鼠會(huì)出現(xiàn)骨骺板內(nèi)軟骨細(xì)胞增殖層和肥大層細(xì)胞減少，導(dǎo)致骺板厚度的降低，補(bǔ)充T4可以逆轉(zhuǎn)這種生長(zhǎng)板的紊亂，而補(bǔ)充生長(zhǎng)激素則不能逆轉(zhuǎn)這種紊亂，提示甲狀腺素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和成熟的作用[12]。在體外研究中也發(fā)現(xiàn)，低于或者近于生理濃度的甲狀腺素（0.1～1.0nM）能夠促進(jìn)生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肥大軟骨細(xì)胞，肥大標(biāo)志基因堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)增加了130%[8]。甲狀腺素對(duì)于軟骨細(xì)胞形成典型的柱狀排列的形態(tài)也有重要作用[13]。因此甲狀腺素被認(rèn)為是能夠誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞成熟為肥大細(xì)胞的激素之一[14-15]。

研究顯示，生理濃度甲狀腺素對(duì)軟骨細(xì)胞的克隆形成和增殖具有明顯的抑制作用[16]，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的MTT結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)中，1nM甲狀腺素組和100nM甲狀腺素組的MTT值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明甲狀腺素對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的作用并無(wú)明顯劑量依賴(lài)關(guān)系。生理濃度甲狀腺素能夠抑制小鼠軟骨細(xì)胞pellets的Sox9基因的表達(dá)，并且促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大分化[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度的甲狀腺素抑制Sox9的作用仍舊存在，提示高濃度的甲狀腺素引起軟骨細(xì)胞改變的途徑與與生理濃度下甲狀腺素通過(guò)核受體引起軟骨細(xì)胞相應(yīng)改變的途徑相同；但是與生理濃度不同的是，高濃度的甲狀腺素反而抑制了軟骨細(xì)胞的肥大分化，這一點(diǎn)與Guangyao Liu等[8]的研究結(jié)果相似：高于100nM的T3可以明顯地抑制軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的去分化和肥大分化，軟骨肥大相關(guān)基因（ColX，MMP13）的表達(dá)均低于常規(guī)培養(yǎng)組。但是在Guangyao Liu等[8]的研究中，甲狀腺素與胰島素和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2聯(lián)合應(yīng)用取得了較好的培養(yǎng)效果，而本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)應(yīng)用了高濃度的甲狀腺素并且發(fā)現(xiàn)抑制了軟骨特異細(xì)胞外基質(zhì)基因和蛋白的表達(dá)，因此推測(cè)高濃度甲狀腺素是通過(guò)與胰島素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的信號(hào)通路相互作用而發(fā)揮藥物作用的，聯(lián)合應(yīng)用后可能會(huì)有較好的效果。

本文探討了高濃度甲狀腺素對(duì)組織工程軟骨形成的影響，顯示高濃度甲狀腺素能夠抑制軟骨細(xì)胞肥大及成骨分化，但同時(shí)也抑制了軟骨細(xì)胞的增殖和分泌基質(zhì)，從而為甲狀腺素在軟骨組織工程中的應(yīng)用提供了參考。

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[收稿日期]2012-03-29[修回日期]2012-06-21

編輯/張惠娟