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      不同基本培養(yǎng)基和激素對(duì)秈稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

      2012-04-29 11:37:33廖鵬飛趙君幸雷發(fā)揚(yáng)余潮李紹波
      湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年18期
      關(guān)鍵詞:秈稻激素培養(yǎng)基

      廖鵬飛 趙君幸 雷發(fā)揚(yáng) 余潮 李紹波

      摘要:以川香29B、中9B、金23B和Ⅱ-32B 4種秈稻的成熟胚為外植體,研究MS、N6、NB和NMB 4種基本培養(yǎng)基,2,4-D與KT或6-BA聯(lián)合使用對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明,4種秈稻在NMB基本培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)率最高,平均誘導(dǎo)率為77.00%~96.00%,其中在NMB中的誘導(dǎo)效果最好,在4種不同基本培養(yǎng)基中愈傷組織總平均誘導(dǎo)率的高低順序依次為川香29B、中9B、Ⅱ-32B、金23B。當(dāng)3.0 mg/L 2,4-D與不同濃度的KT或6-BA聯(lián)合使用時(shí),KT濃度為0.1 mg/L時(shí),川香29B和中9B愈傷組織誘導(dǎo)率高;對(duì)于Ⅱ-32B,KT濃度為0.6 mg/L愈傷組織誘導(dǎo)率較高;6-BA濃度為0.4 mg/L時(shí),川香29B愈傷組織誘導(dǎo)率最高;對(duì)于中9B和Ⅱ-32B,添加0.1 mg/L的6-BA最有利于愈傷組織的誘導(dǎo);而對(duì)于金23B,無論是添加KT或6-BA都會(huì)抑制愈傷組織的誘導(dǎo)。

      關(guān)鍵詞:秈稻;愈傷組織誘導(dǎo);培養(yǎng)基;激素

      中圖分類號(hào):S511.2+1;Q813.1+2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2012)18-4121-04

      Effects of Different Basal Medium and Phytokinin on Callus Induction of Indica Rice Mature Embryos

      LIAO Peng-fei1,2,ZHAO Jun-xing1,LEI Fa-yang1,YU Chao1,2,LI Shao-bo2

      (1. Teaching Center for Experimental Biology / School of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China; 2. Key Laboratory of Molecular Biology and Gene Engineering in Jiangxi Province, Nanchang University, Nanchang 330031, China)

      Abstract:Effects of four basal medium(MS,N6,NB and NMB) and two kinds of phytokinin(KT,6-BA) on callus induction from mature embryos of four indica rice varieties(Chuanxiang29B, Zhong9B, Jin23B, Ⅱ-32B) were investigated. The results showed that the most efficient basal medium was NMB as the average callus induction rates ranged from 77.00% to 96.00%. The order of average rate from high to low was Chuanxiang29B, Zhong9B, Ⅱ-32B, Jin23B. When 3 mg/L 2, 4-D was applied with 0.1 mg/L KT or 0.4 mg/L 6-BA, the induction rate of Chuangxiang29B was the highest. For Zhong9B, the combination of 3 mg/L 2, 4-D with 0.1 mg/L KT or 0.1 mg/L 6-BA was optimum. ForⅡ-32B, the combination of 3 mg/L 2, 4-D with 0.6 mg/L KT or 0.1 mg/L 6-BA was optimum. However, the callus formation of Jin23B would be inhibited by adding either 6-BA or KT.

      Key words: indica rice; callus induction; basal medium; phytokinin

      農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)在水稻外源基因轉(zhuǎn)化中取得了很大的成功[1-3],利用該技術(shù)不僅可以把感興趣的基因?qū)氲剿净蚪M中,進(jìn)而培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗的水稻新品種[4,5],而且也為水稻基因功能研究提供重要手段,如通過T-DNA插入構(gòu)建突變體庫(kù)、基因打靶等[6,7]。水稻胚性愈傷組織是農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的良好受體,因此水稻愈傷組織的形成和狀態(tài)是直接影響著水稻遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素。

      秈稻和粳稻是栽培稻的兩個(gè)主要亞種,粳稻的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成熟,愈傷組織誘導(dǎo)容易,誘導(dǎo)出來的愈傷組織是胚性愈傷組織,生長(zhǎng)速度快,再生率高,并且許多粳稻品種已建立了基于愈傷組織的重復(fù)性好、轉(zhuǎn)化頻率高的遺傳轉(zhuǎn)化體系[8,9]。而栽培面積占全球水稻80%的秈稻卻具有不良的組織培養(yǎng)特性,其誘導(dǎo)率和再生率都比粳稻低得多,后續(xù)繼代過程中容易褐化,且不同品種秈稻之間組織培養(yǎng)特性差別很大[10,11],使得秈稻遺傳轉(zhuǎn)化效率低,甚至難以進(jìn)行轉(zhuǎn)化,這樣極大地阻礙了秈稻遺傳轉(zhuǎn)化的發(fā)展。

      水稻成熟胚由于具有取材容易、不受季節(jié)限制、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)是獲得愈傷組織較好的外植體。秈稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率和質(zhì)量除與基因型及外植體有關(guān)外,外源激素濃度、培養(yǎng)基成分也是重要的影響因素。一些研究表明在秈稻愈傷組織誘導(dǎo)中適當(dāng)改變培養(yǎng)基成分、調(diào)節(jié)外源激素濃度及其配比等可以在一定程度上提高愈傷組織誘導(dǎo)率和質(zhì)量[12-14]。因此,研究4種不同基本培養(yǎng)基、不同濃度的KT、6-BA對(duì)川香29B、中9B、金23B、Ⅱ-32B 4種常用的秈型雜交水稻保持系成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響,以期提高秈稻愈傷組織的誘導(dǎo)率和質(zhì)量,篩選出組織培養(yǎng)特性較好的秈稻品種,為秈稻基因工程和分子育種研究的進(jìn)一步發(fā)展打下一定基礎(chǔ)。

      1材料與方法

      1.1材料

      秈稻保持系中9B、金23B、Ⅱ-32B和川香29B種子由南昌大學(xué)江西省分子生物學(xué)基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供?;瘜W(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,試驗(yàn)所用激素為Sigma公司產(chǎn)品。

      1.2方法

      1.2.1基本培養(yǎng)基的組分與含量以MS、N6、NB和NMB作為秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的4種基本培養(yǎng)基,組分與含量見表1,配制完成后滅菌,倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中備用。

      1.2.2含不同濃度KT和6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制以MS為基本培養(yǎng)基,加入3.0 mg/L 2,4-D以及KT或6-BA,使KT或6-BA最終濃度分別為0、0.1、0.2、0.4和0.6 mg/L,滅菌后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中備用。

      1.2.3種子的滅菌與接種選取飽滿成熟的種子,剝?nèi)シf殼后,先用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇浸泡種子1 min,用1 g/L HgCl2消毒5 min,再用有效氯為3%的次氯酸鈉溶液消毒30 min,期間搖動(dòng)數(shù)次,然后用無菌水洗滌5遍。將洗好的種子放在鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中晾干,然后將滅菌的種子接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基上,每種處理接種50粒種子,每種處理重復(fù)3次,放入人工氣候室中在26 ℃暗培養(yǎng)。

      1.2.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析20 d后記錄愈傷組織的誘導(dǎo)率與狀態(tài)。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行處理,對(duì)不同處理的誘導(dǎo)率分別進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和顯著性測(cè)驗(yàn)。誘導(dǎo)率=[產(chǎn)生愈傷組織的種胚數(shù)∕接種的種胚數(shù)]×100%。

      2結(jié)果與分析

      2.1不同基本培養(yǎng)基對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

      在水稻組織培養(yǎng)中,應(yīng)用的基本培養(yǎng)基有MS、N6、B5、CC以及改良的組合培養(yǎng)基,如NB、MB、NMB等[15,16]。研究采用了MS、N6、NB、NMB 4種基本培養(yǎng)基對(duì)川香29B、中9B、金23B和Ⅱ-32B 4種秈稻雜交水稻保持系成熟胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo),3~4 d后開始發(fā)芽,一周后盾片上開始有愈傷組織生長(zhǎng),10 d后拔掉長(zhǎng)出的芽。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和狀態(tài),結(jié)果如表2所示。

      從表2和圖1可知,川香29B、中9B、金23B和Ⅱ-32B的成熟胚在4種基本培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導(dǎo)率不同,在NMB基本培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率最高,平均誘導(dǎo)率為77.00%~96.00%,并且誘導(dǎo)出來的愈傷組織狀態(tài)比較好,說明NMB基本培養(yǎng)基成分比較適合用于這4種秈稻愈傷組織的誘導(dǎo),NMB基本培養(yǎng)基是由N6大量元素、MS微量元素和B5維生素等組成,這種組合在一定程度上改善了4種秈稻的組織培養(yǎng)效果。4種秈稻在N6基本培養(yǎng)基中雖然也具有較高的誘導(dǎo)率,但是川香29B、金23B、Ⅱ-32B這3個(gè)秈稻品種誘導(dǎo)出來的愈傷組織的狀態(tài)不佳,顏色呈乳白色,愈傷組織呈大塊或疏松狀,在后續(xù)的繼代中生長(zhǎng)速度慢;在4種基本培養(yǎng)基中,川香29B的誘導(dǎo)率較高,且在后續(xù)的繼代中不容易褐化,分化率較高,其次為中9B、Ⅱ-32B,而金23B愈傷組織誘導(dǎo)率較低。

      2.2添加不同濃度的KT對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

      將川香29B、中9B、金23B和Ⅱ-32B 4種秈稻的成熟胚分別接種到以MS作為基本培養(yǎng)基并含有不同濃度KT的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率,結(jié)果如表3所示。

      從表3可知,川香29B和中9B在KT濃度為0.1 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高,而后隨著KT濃度進(jìn)一步升高愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì),KT濃度為0.4 mg/L以上時(shí),川香29B和中9B兩個(gè)秈稻品種的愈傷組織誘導(dǎo)率下降顯著,而對(duì)于金23B,在KT濃度為低濃度0.1 mg/L時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率顯著下降,說明KT可能會(huì)抑制金23B愈傷組織的形成。對(duì)于Ⅱ-32B,在試驗(yàn)的KT濃度范圍內(nèi),增加KT濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不顯著,在KT濃度為0.6 mg/L愈傷組織誘導(dǎo)率較高??偟膩碚f,KT對(duì)不同的秈稻品種的成熟胚誘導(dǎo)愈傷組織的作用效果不同。

      2.3添加不同濃度的6-BA對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

      將川香29B、中9B、金23B和Ⅱ-32B 4種秈稻種子分別接種到以MS為基本培養(yǎng)基并含有不同濃度6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。20 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率,結(jié)果如表4所示。

      從表4可知,對(duì)于川香29B,添加了6-BA后愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的提高,其中添加了0.4 mg/L 6-BA的愈傷組織的誘導(dǎo)率最高,平均值為89.60%,與對(duì)照(不添加6-BA)相比差異達(dá)到顯著水平。對(duì)于Ⅱ-32B,添加了6-BA后愈傷組織誘導(dǎo)率有顯著的提高,其中6-BA濃度為0.1 mg/L時(shí),其愈傷組織誘導(dǎo)率最高,隨著6-BA濃度的增高,對(duì)Ⅱ-32B成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率影響不大。對(duì)于中9B,6-BA濃度為0.1、0.2 mg/L時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率最高,隨著6-BA濃度進(jìn)一步增高,其愈傷組織誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)。而對(duì)于金23B,添加6-BA后愈傷組織誘導(dǎo)率下降,這與前面添加KT激素的結(jié)果相一致,說明兩種激素對(duì)金23B成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)具有不利影響,從以上結(jié)果可知,6-BA對(duì)不同基因型的秈稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響也各有不同。

      3小結(jié)與討論

      3.1小結(jié)

      基本培養(yǎng)基成分對(duì)秈稻愈傷組織的誘導(dǎo)有一定的影響,4種秈稻(川香29B、中9B、金23B、Ⅱ-32B)在MS、N6、NB、NMB基本培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)效果不同,其中在NMB上的誘導(dǎo)效果最好,4種秈稻品種的組織培養(yǎng)特性也存在差異,其中川香29B的組織培養(yǎng)特性最好。植物外源激素對(duì)不同基因型的秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響不同,因此,在不同基因型秈稻的組織培養(yǎng)試驗(yàn)中,選擇合適的基本培養(yǎng)基和適當(dāng)?shù)募に嘏浔仁翘岣叨i稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率和質(zhì)量的重要前提。

      3.2不同基本培養(yǎng)基對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

      水稻胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是水稻遺傳轉(zhuǎn)化中的重要環(huán)節(jié),愈傷組織的狀態(tài)直接影響著遺傳轉(zhuǎn)化頻率,所以提高愈傷組織的誘導(dǎo)率和質(zhì)量很重要。胚性愈傷組織的誘導(dǎo)除主要與水稻基因型和外植體類型有關(guān)外[10,11],同時(shí)也受組織培養(yǎng)過程眾多因素(如溫度、pH、培養(yǎng)基的成分等)的影響,其中培養(yǎng)基的成分就是其中一個(gè)關(guān)鍵影響因子。

      很多學(xué)者也研究了常用的培養(yǎng)基以及改良過的培養(yǎng)基對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)率的影響,取得了一定的進(jìn)展[12,17],但是所得出的最佳培養(yǎng)基成分不具有普遍適用性,往往只能適合某一種或者某些品種的水稻。本研究利用的4種基本培養(yǎng)基,即MS、N6、NB、NMB對(duì)4種秈稻川香29B、中9B、金23B、Ⅱ-32B成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不同,最適的基本培養(yǎng)基是NMB。這與高麗麗等[15]以秋桂矮11、華秈占、萬秈占45這3個(gè)秈稻品種種子為研究對(duì)象的結(jié)果相一致,其原因可能是秈稻愈傷組織形成過程中需要較多種類的有機(jī)成分,而NMB能夠給愈傷組織提供比較充足的營(yíng)養(yǎng)元素,有利于愈傷組織的誘導(dǎo)[18],但是NMB是否還適用于其他秈稻品種愈傷組織的誘導(dǎo),還有待進(jìn)一步探討。研究所選的4種秈稻品種,其愈傷組織誘導(dǎo)率之間也有一定的差異,誘導(dǎo)率最高的秈稻品種是川香29B,其誘導(dǎo)出來的愈傷組織的狀態(tài)較其他3種要好,不容易褐化,并且分化率也較高,說明川香29B具有較好的組織培養(yǎng)特性。因此,可望作為進(jìn)行大規(guī)模遺傳轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)材料。

      3.32,4-D與KT或6-BA聯(lián)合使用對(duì)秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

      2,4-D對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織的形成和生長(zhǎng)起著非常重要的作用,一般誘導(dǎo)粳稻的愈傷組織時(shí),2,4-D添加量為2.0 mg/L比較適宜,而前期的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2,4-D的濃度為3.0 mg/L時(shí),4種水稻能產(chǎn)生較高的愈傷組織誘導(dǎo)率,很多學(xué)者認(rèn)為生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素配合使用可以在一定程度上提高愈傷組織誘導(dǎo)率和狀態(tài)[19,20]。凌定厚等[21]的研究認(rèn)為2,4-D與KT是秈稻體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基本因素。田文忠[22]對(duì)秈稻愈傷組織再生頻率的研究發(fā)現(xiàn),無論選用幼胚、成熟種子胚或經(jīng)過繼代的愈傷組織,在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入NAA和KT既可以改善秈稻愈傷組織的質(zhì)量,還可以顯著提高秈稻愈傷組織的再生頻率。郭曉麗[23]的研究認(rèn)為,2,4-D與6-BA配合使用更有利于旱稻愈傷組織的誘導(dǎo),研究將3.0 mg/L 2,4-D和不同濃度的KT或6-BA聯(lián)合使用誘導(dǎo)4種秈稻愈傷組織,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4種秈稻品種中加入一定濃度的KT或6-BA,對(duì)川香29B、中9B、Ⅱ-32B品種秈稻愈傷組織的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用,對(duì)金23B愈傷組織的誘導(dǎo)反而有抑制作用,因此外源激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響要依據(jù)秈稻品種而論,可能是因?yàn)橛鷤M織誘導(dǎo)率高低不僅與外源激素種類和配比有關(guān),還與不同品種秈稻的內(nèi)源激素的種類和含量有密切的關(guān)系[24]。

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      收稿日期:2011-12-07

      基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30860155);江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ12013)

      作者簡(jiǎn)介:廖鵬飛(1980-),男,湖南新田人,講師,在讀博士研究生,研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)、基因打靶,(電話)13870841992(電子信箱)

      lfp_1980@163.com;通訊作者,李紹波,博士,(電話)0791-83969537(電子信箱)heshaoboli@yahoo.com.cn。

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