陜北果樹(shù)根際解磷菌的初步研究

高小朋 景斌斌 賀曉龍 任桂梅

摘要：試驗(yàn)利用ＰＫＯ培養(yǎng)基從陜北果樹(shù)根際土壤中篩選得到４株可有效分解利用難溶性磷酸鹽的菌株，對(duì)其解磷及促植物生長(zhǎng)能力進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，試驗(yàn)菌株在利用無(wú)機(jī)磷的同時(shí)，可產(chǎn)生有機(jī)磷、ＮＨ３和ＨＣＮ，可有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。試驗(yàn)可為陜北果樹(shù)專(zhuān)用菌肥的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：果樹(shù)根際；解磷菌；代謝產(chǎn)物；陜北

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｓ１５４．３９文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）18－3961-02

Preliminary Research of Phosphorus-Degrading Strains in Rhizosphere of Fruit Trees in Northern Shaanxi

ＧＡＯ Ｘｉａｏ－ｐｅｎｇ，ＪＩＮＧ Ｂｉｎ－ｂｉｎ，ＨＥ Ｘｉａｏ－ｌｏｎｇ，ＲＥＮ Ｇｕｉ－ｍｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｙａｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙａｎａｎ ７１６０００，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｏｆ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ ｉｎ ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｈａａｎｘｉ ｂｙ ＰＫＯ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅｓｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｄｕｃｅ ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ， ＮＨ３ ａｎｄ ＨＣＮ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｐｒｏｍｏｔｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｌａｉｄ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌｍａｎｕｒｅ ｆｏｒ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ ｉｎ ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｈａａｎｘｉ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ ｏｆ ｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ； ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ； ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ

磷素是植物生長(zhǎng)的重要養(yǎng)分因子，但是由于施入土壤的大部分磷與土壤中的Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋等結(jié)合形成難溶性磷酸鹽，成為生物低效磷［１］。研究表明，解磷微生物可以分泌有機(jī)酸，有機(jī)酸與土壤中的Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ａｌ３＋等離子反應(yīng)，從而使ＰＯ４３＋釋放出來(lái)，有助于植物對(duì)磷素的吸收［２，３］。大部分解磷菌均屬于根際微生物，由于受土壤物理結(jié)構(gòu)、有機(jī)質(zhì)含量、土壤類(lèi)型、土壤肥力、耕作方式等因素的影響，在數(shù)量上存在較大差異。研究從陜北蘋(píng)果樹(shù)、棗樹(shù)根際土壤中分離篩選高效解磷菌，并對(duì)其解磷及促植物生長(zhǎng)能力進(jìn)行研究，以期為陜北蘋(píng)果樹(shù)、棗樹(shù)專(zhuān)用菌肥的研制生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

１材料與方法

１．１材料

１．１．１供試土樣試驗(yàn)所用土樣分別采自陜北洛川縣蘋(píng)果園和延川縣棗園。

１．１．２試劑ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）、ＨｇＣｌ２（分析純，貴州省銅仁化學(xué)試劑廠）、ＫＩ（分析純，天津天鋒化學(xué)品有限公司）、氨基乙酸（甘氨酸，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、２，４，６—三硝基苯酚（分析純，廣州臺(tái)山粵僑試劑有限公司）、Ｎｅｓｓｌｅｒｓ試劑［4］。

１．１．３儀器ＵＶ－１２４０紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（ＬＳ－Ｂ５０Ｌ，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠）、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（ＰＹＸ－ＤＨＳ－４０×５０－ＢＳ，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）、汽浴式振蕩器（ＺＪＳ－１３２０，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）等。

１．１．４培養(yǎng)基ＰＫＯ培養(yǎng)基［5］、ＬＢ培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基、ＮＢ培養(yǎng)基［6］。

１．２方法

１．２．１解磷菌的篩選①初篩。取土樣進(jìn)行高倍稀釋?zhuān)♂屢和坎加冢校耍掀桨迳?，２?℃培養(yǎng)７ ｄ后，可在平板上產(chǎn)生透明圈的即為解磷菌，劃線法分離得到單菌落，４ ℃保存?zhèn)溆?。②?fù)篩。復(fù)篩主要測(cè)定初篩得到菌株解磷能力的穩(wěn)定性［7］。將初篩得到的解磷菌接種于ＬＢ固體培養(yǎng)基上，每２４ ｈ轉(zhuǎn)接１次，連續(xù)轉(zhuǎn)接２０次后，在ＰＫＯ平板上菌落周?chē)钥僧a(chǎn)生透明圈的為具有穩(wěn)定解磷能力的解磷菌，將其作為下一步的試驗(yàn)菌株，４ ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２試驗(yàn)菌株解磷能力的測(cè)定①解磷效果的定性測(cè)定。取復(fù)篩得到的試驗(yàn)菌株，接種于加溴甲酚紫的ＰＫＯ平板上，２８ ℃培養(yǎng)８ ｄ，測(cè)定解磷圈直徑（Ｄ）和菌落直徑（ｄ），根據(jù)Ｄ／ｄ的大小來(lái)確定其解磷能力。②解磷效果的定量測(cè)定［8－１1］。取定性測(cè)定的解磷能力較強(qiáng)的試驗(yàn)菌株，接種于ＬＢ液體培養(yǎng)基中，于２８ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ活化２４ ｈ，取活化后的菌液以１０％的接種量接入ＰＫＯ培養(yǎng)基中，２８ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ培養(yǎng)，每隔１ ｄ用磷鉬藍(lán)比色法［１2］測(cè)定培養(yǎng)液中有機(jī)磷的含量，連續(xù)測(cè)定，確定試驗(yàn)菌株對(duì)無(wú)機(jī)磷的分解情況。

１．２．３試驗(yàn)菌株代謝產(chǎn)物的定性測(cè)定［１3］①ＨＣＮ的測(cè)定。將試驗(yàn)菌株劃線接種于添加了４．４ ｇ／ｍＬ甘氨酸的ＮＢ平板上，另將浸過(guò)２％碳酸鈉、０．５％苦味酸溶液（２，４，６—三硝基苯酚）的濾紙置于培養(yǎng)基上，密封，２８℃、４ ｄ后，濾紙顏色由橘黃色變?yōu)榧t色的說(shuō)明有ＨＣＮ產(chǎn)生。②ＮＨ３鑒定。將試驗(yàn)菌株以２％接種量接入蛋白胨水培養(yǎng)基中，２８ ℃、４８～７２ ｈ培養(yǎng)，加入Ｎｅｓｓｌｅｒｓ試劑后，顏色由褐色變?yōu)辄S色的表明有ＮＨ３產(chǎn)生。

２結(jié)果與分析

２．１解磷菌分離純化結(jié)果

經(jīng)過(guò)ＰＫＯ平板的初步篩選，共分離到２０株解磷菌，分別編號(hào)為ＢＭ－１至ＢＭ－２０，經(jīng)過(guò)復(fù)篩，有１３株菌的解磷能力喪失。這可能是一部分解磷菌的解磷能力是對(duì)環(huán)境中的磷素的一種適應(yīng)性表達(dá)，當(dāng)環(huán)境中磷素減少或缺失時(shí)，其解磷能力也隨之消失。選擇剩余的４株菌（ＢＭ－１、ＢＭ－５、ＢＭ－６、ＢＭ－１５）作為下一步的試驗(yàn)菌株。

２．２試驗(yàn)菌株解磷能力的測(cè)定結(jié)果

２．２．１解磷能力定性測(cè)定結(jié)果各試驗(yàn)菌株在加溴甲酚紫的ＰＫＯ平板上的菌落及透明圈的直徑大小見(jiàn)表１。由表１可知，4株試驗(yàn)菌株中，菌株ＢＭ－１５的解磷能力最強(qiáng)，菌株ＢＭ－６的解磷能力較弱。還需對(duì)４株試驗(yàn)菌株進(jìn)行后續(xù)解磷能力的定量測(cè)定。

２．２．２解磷能力的定量測(cè)定４株解磷能力較強(qiáng)的菌株９ ｄ內(nèi)使培養(yǎng)液中有機(jī)磷含量發(fā)生變化，其具體情況見(jiàn)圖１。由圖１可知，經(jīng)菌株ＢＭ－１、ＢＭ－５、ＢＭ－１５作用，從第一天到第七天，培養(yǎng)液中的有機(jī)磷含量呈增加趨勢(shì)，到第七天達(dá)到最高值，分別為３．３３０、３．０４６、３．０５６ μｇ／ｍＬ，而菌株ＢＭ－６是在培養(yǎng)了８ ｄ時(shí)培養(yǎng)液中有機(jī)磷的含量達(dá)到最大為３．４８４ μｇ／ｍＬ，這說(shuō)明試驗(yàn)菌株在代謝過(guò)程中，可將難溶性磷酸鹽有效地分解利用，轉(zhuǎn)化成有機(jī)磷。

２．３試驗(yàn)菌株代謝產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果

２．３．１試驗(yàn)菌株產(chǎn)ＨＣＮ的測(cè)定結(jié)果培養(yǎng)４ ｄ后，４株試驗(yàn)菌株所生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上濾紙的顏色均由橘黃色轉(zhuǎn)為紅色，說(shuō)明４株解磷菌均產(chǎn)生了ＨＣＮ。

２．３．２試驗(yàn)菌株產(chǎn)ＮＨ３的測(cè)定結(jié)果４株試驗(yàn)菌株在蛋白胨水培養(yǎng)基中培養(yǎng)２～３ ｄ，加入Ｎｅｓｓｌｅｒｓ試劑后，培養(yǎng)液顏色均由褐色轉(zhuǎn)為黃色，說(shuō)明４株試驗(yàn)菌株均可產(chǎn)ＮＨ３。

３小結(jié)與討論

１）試驗(yàn)經(jīng)過(guò)篩選得到４株高效解磷菌，４株試驗(yàn)菌株在分解利用難溶性磷酸鹽的同時(shí)還可產(chǎn)生有機(jī)磷、ＨＣＮ和ＮＨ３，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

２）４株試驗(yàn)菌株可以有效地利用難溶性無(wú)機(jī)磷，產(chǎn)生有機(jī)磷、ＨＣＮ和ＮＨ３，為菌肥的生產(chǎn)打下了基礎(chǔ)。這是由于解磷微生物產(chǎn)生的ＨＣＮ可以抑制病原菌的繁殖，ＮＨ３和其他代謝產(chǎn)物不僅能刺激植物快速生長(zhǎng)，還可提高根際酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性，減少根系有機(jī)酸、磷酸酶等物質(zhì)的分泌，在很大程度上減輕了植物由于營(yíng)養(yǎng)缺乏而導(dǎo)致的根際酸化現(xiàn)象［１4，１5］。

３）４株試驗(yàn)菌株可作為解磷優(yōu)勢(shì)菌。然而，解磷菌分解難溶性磷的能力，除了受菌株遺傳特性的影響外，還和其生長(zhǎng)條件和環(huán)境有關(guān)。解磷菌一般對(duì)環(huán)境中的磷素有一個(gè)適應(yīng)性表達(dá)的過(guò)程，所以，要確定這些菌株在陜北果區(qū)土壤中的定殖和生存能力以及實(shí)際解磷促生的效果還需深入研究。

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（責(zé)任編輯鄭威）

收稿日期：２０１２－０４－２６

基金項(xiàng)目：陜西省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（２０１１Ｋ０２－１１）

作者簡(jiǎn)介：高小朋（１９７６－），男，陜西洛川人，講師，碩士，主要從事資源與環(huán)境微生物學(xué)研究，（電話）０９１１－２３３２０３０（電子信箱）

ｇａｏｘｉａｏｐｅｎｇｙｄ＠１６３．ｃｏｍ。