濃縮生長(zhǎng)因子在骨組織再生和修復(fù)上的作用研究進(jìn)展

寧佳 張瑋 　 柳洪志

骨組織再生過(guò)程發(fā)生異常會(huì)導(dǎo)致骨量或骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。而臨床中涉及骨組織再生的領(lǐng)域甚多，如：骨折的修復(fù)重建、骨腫瘤術(shù)后骨缺損的修復(fù)，尤其在種植外科領(lǐng)域中齒槽嵴的增高、上頜竇提升術(shù)、種植體植入后周圍支持骨的修復(fù)所涉及到的骨組織再生和修復(fù)問(wèn)題是近年研究的熱點(diǎn)之一。因此，深入研究骨組織再生和修復(fù)的過(guò)程，對(duì)于臨床應(yīng)用具有十分重要的意義。新一代的血漿提取物-濃縮生長(zhǎng)因子（CGF，Concentrate Growth Factors），在骨組織再生和修復(fù)中的作用越來(lái)越引起人們的關(guān)注。本文就濃縮生長(zhǎng)因子在骨組織再生和修復(fù)上的作用研究進(jìn)展綜述如下。

1 CGF的發(fā)展史

50年前醋酸纖維素過(guò)濾器被用于神經(jīng)和肌腱再生實(shí)驗(yàn)[1]，Murray等[2]在狗的腿骨缺損區(qū)應(yīng)用一種塑料支架，這種方法促使缺損區(qū)有大量新骨生成。Hurley等[3]在兔子和老鼠的顱骨缺損區(qū)安放機(jī)械屏障也有成功的骨再生效果[4-5]，這些研究提供了大量的證據(jù)，表明機(jī)械屏障能阻止軟組織進(jìn)入骨缺損區(qū)，顯著提高骨再生和修復(fù)。然而，大多數(shù)早期研究者的成功歸功于他們意識(shí)到屏障膜的保存及保護(hù)血凝塊的作用，但沒(méi)有意識(shí)到屏障膜為成骨細(xì)胞創(chuàng)造了獨(dú)立封閉的空間。1982年，Nyman[6]第一次把屏障膜技術(shù)用于牙周病的治療獲得成功，并提出了引導(dǎo)組織再生（Guided Tissue Regeneration，GTR）的概念，其后GTR技術(shù)成為牙周病治療的一項(xiàng)常用手段。1993年，Buser等[7]提出了引導(dǎo)骨再生的概念?，F(xiàn)在，GBR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在牙槽外科、牙周科和口腔種植領(lǐng)域。在GBR技術(shù)中各種骨替代材料與血漿提取物的混合使用在目前的臨床應(yīng)用中被廣泛使用。而血漿提取物的研究大致經(jīng)歷了Platelet-rich plasma（PRP），Platelet-rich fibrin（PRF），Concentrate Growth Factors（CGF）三個(gè)階段。1984年，Assoion等[8]發(fā)現(xiàn)了人血漿中提取的富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）中含有多種生長(zhǎng)因子，當(dāng)PRP與氯化鈣以及牛凝血酶混合后，各種生長(zhǎng)因子即從血小板中的α顆粒中釋放出來(lái)。它是一種自體來(lái)源的通過(guò)梯度離心獲得的富含血小板衍生生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β等的血漿提取物[9]。1993年，Hood等[10]提出了PRP凝膠（PRPgel ）概念，亦即血小板凝膠（platelet gel）。PRP gel是纖維素凝膠的一種改良應(yīng)用，由自體全血離心產(chǎn)生PRP，然后與凝血酶和氯化鈣混合而成的一種具有粘性的膠狀凝塊。PRP凝膠與纖維素凝膠最本質(zhì)的區(qū)別是PRP凝膠含有高度濃縮的血小板及其固有的濃縮的纖維素原。血小板被凝血酶激活，釋放出一系列的因子而發(fā)揮其作用。PRP凝膠最初被作為一種生物凝膠和屏障膜而應(yīng)用于臨床[11]。1997年，Whitman率先將自體的PRP應(yīng)用于口腔臨床研究中并取得了良好效果，隨后PRP技術(shù)成為口腔種植骨缺損修復(fù)和骨整合研究中的熱點(diǎn)[12]。目前，對(duì)于PRP的研究和應(yīng)用還存在較大爭(zhēng)議。主要集中在PRP的確切作用機(jī)制、PRP能發(fā)揮作用的劑量、PRP的安全性問(wèn)題、PRP能否引起感染等[13]。

作為第二代濃縮血小板，富血小板纖維蛋白（PRF）是由Choukroun首次引入的[14]。PRF是富纖維蛋白凝膠，由患者靜脈中抽取的新鮮血液制作而成，屬于新一代的血小板濃縮物，它制備簡(jiǎn)單無(wú)需任何生物添加劑的處理。它緩慢的聚合似乎形成了類似自然的纖維網(wǎng)絡(luò)。在PRF通過(guò)離心分離的制備過(guò)程中，血小板被激活的同時(shí)大量脫顆粒細(xì)胞中蘊(yùn)含的重要的生長(zhǎng)因子釋放出來(lái)，在對(duì)PRF進(jìn)行加工的同時(shí)白細(xì)胞也隱藏在細(xì)胞因子中，對(duì)炎癥和止血起到作用，并且加速組織愈合和血管生成，組織學(xué)評(píng)估表明PRF能夠縮短骨形成時(shí)間[15]。PRF方案無(wú)需凝血酶之類的化學(xué)添加劑即可制成凝膠狀物體。因此，PRF無(wú)交叉污染之憂。濃縮生長(zhǎng)因子（CGF）是Sacco首次開(kāi)發(fā)出來(lái)的[16]。與PRF一樣，CGF由靜脈血分離制作而成。不過(guò)，該技術(shù)的離心速度有所不同。CGF是一種具有完全獨(dú)特屬性的愈合型生物材料。外科醫(yī)生可以將CGF作為隔膜來(lái)加速軟組織愈合或與骨移植物混合，以加快新骨重建。CGF無(wú)需任何化學(xué)或過(guò)敏性添加劑（如：凝血酶或抗凝劑），因此，不會(huì)引起病毒性傳染病。

2CGF的基本原理和分離技術(shù)

2.1基本原理：CGF血纖維蛋白分子結(jié)構(gòu)為三鍵式聯(lián)結(jié)，呈立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可有效地滯納血小板及各種循環(huán)分子（如細(xì)胞因子）。當(dāng)CGF應(yīng)用于損傷的組織時(shí)，通過(guò)引導(dǎo)損傷組織的再血管化，免疫調(diào)節(jié)以及捕獲循環(huán)血中的干細(xì)胞，最終促進(jìn)組織愈合再生和修復(fù)。

2.2分離技術(shù)：將患者的靜脈血采集10ml于試管中，并立即放入Medifuge（Silfradent，意大利）離心加速機(jī)分離處理。設(shè)定制備CGF程序，旋轉(zhuǎn)12min后，可見(jiàn)試管中分為三層（最上層為細(xì)胞質(zhì)，中間纖維蛋白凝結(jié)物即CGF，底層為紅細(xì)胞及血小板），將血清分離出來(lái)，并存儲(chǔ)在特定的存儲(chǔ)器皿中。CGF被分離出來(lái)（其中大量的生長(zhǎng)因子位于中間層與底層的界面上，所以分離的時(shí)候應(yīng)一并分離出來(lái)），并存儲(chǔ)在稀釋的抗菌溶液中（Lincocin 600mg）。底層的紅細(xì)胞部分及血小板立即存儲(chǔ)在器皿中，其中富含紅細(xì)胞、血小板以及鐵、鈣和其他基本元素、可以用來(lái)制備截骨術(shù)中的填料，以便混合生物材料及自體骨。將CGF切割成1～2mm的微粒，隨后依次與收集的紅細(xì)胞部分和骨代材料混合。為增加混合物的柔軟度，可添加一些血清。使用特定的收集設(shè)備（Silfradent 意大利）旋轉(zhuǎn)6s左右將其混合并攪勻。另外，CGF具有極大的可模制性，通過(guò)壓縮，以薄膜的形式使用，也可以將其撕裂，以碎片的形式使用。

3 CGF的主要成分及生物學(xué)特性

CGF是一種修補(bǔ)生物材料，其中含有濃縮生長(zhǎng)因子及纖維蛋白，具有改善并增強(qiáng)組織再生的獨(dú)特性質(zhì)，是再生醫(yī)療領(lǐng)域中組織刺激的新技術(shù)。CGF技術(shù)是以患者自身靜脈血為原料，通過(guò)梯度密度離心的方法，將其分為血漿細(xì)胞活素類、血小板、活性纖維蛋白、粒性白細(xì)胞、濃縮生長(zhǎng)因子、抗體，再單獨(dú)或聯(lián)合其他生物材料注入硬組織缺損或軟組織創(chuàng)傷處，從而修補(bǔ)缺損，誘導(dǎo)生長(zhǎng)，加速局部創(chuàng)傷的愈合并提高愈合質(zhì)量。其中的濃縮生長(zhǎng)因子包含：轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、類胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）、骨形成蛋白（BMPs）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等[17-18]。CGF具有柔性成型血凝塊及彈性有機(jī)纖維蛋白網(wǎng)格，促進(jìn)血管生成及移植物存活，從血小板及濃縮纖維蛋白中釋放出的生長(zhǎng)因子的生物學(xué)特性，并具有修復(fù)促進(jìn)和調(diào)節(jié)功能。

4 CGF在創(chuàng)口愈合過(guò)程中的作用

創(chuàng)口愈合過(guò)程可分為三個(gè)不同的階段：生化活動(dòng)階段、細(xì)胞活動(dòng)階段和細(xì)胞反應(yīng)階段[19]。生化活動(dòng)階段即把機(jī)械損傷轉(zhuǎn)化為機(jī)體能接受的生化信號(hào)，這一反應(yīng)是由血清中的Hagemann因子啟動(dòng)的。當(dāng)機(jī)體受損傷后，創(chuàng)緣間充以血液和含有纖維蛋白的滲出液，并迅速凝集成塊[20]，而血清中的Hagemann因子則引起局部微循環(huán)障礙，血漿與組織蛋白和基底膜接觸，這樣便激活了Hagemann因子和血循環(huán)中的血小板。被激活后的Hagemann因子反過(guò)來(lái)再促進(jìn)上述反應(yīng)進(jìn)一步生成，并導(dǎo)致細(xì)胞活動(dòng)開(kāi)始，在組織內(nèi)出現(xiàn)白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，并侵入血塊將死亡的細(xì)胞，可能存在的細(xì)菌及無(wú)活力的組織吞噬消化，凝血反應(yīng)產(chǎn)生纖維素促進(jìn)止血，凝血酶則引起血小板a粒子的釋放。補(bǔ)體系統(tǒng)產(chǎn)生許多生物活性分子，包括C5a、CD34，對(duì)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞起趨化吸附作用。同時(shí)，血漿中的血漿酶降解纖維素，得到的纖維素降解產(chǎn)物是一種自我活化的生物分子，可使單核細(xì)胞遷移和血管舒張。在此階段中，CGF通過(guò)血小板釋放各種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)產(chǎn)生新的血管，引導(dǎo)損傷組織進(jìn)行再血管化，進(jìn)行自身的免疫調(diào)節(jié)以及捕獲循環(huán)血中的干細(xì)胞（全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、單能干細(xì)胞），使細(xì)胞移到缺損區(qū)。細(xì)胞反應(yīng)階段開(kāi)始作用主要靠組織細(xì)胞、成纖維細(xì)胞滲入血凝塊，組織細(xì)胞可分化為成纖維細(xì)胞，具有膠原的能力，血漿和血細(xì)胞因子起到修復(fù)、消炎和止痛作用，血小板傳遞信號(hào)，釋放最重要的PDGF，TGF-β和IGF-1生長(zhǎng)因子，使局部的間葉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行遷移、分化和增殖。在細(xì)胞反應(yīng)的最后階段，單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞，并輔助中性粒細(xì)胞加強(qiáng)機(jī)體防御，促進(jìn)創(chuàng)口愈合。

5CGF的臨床應(yīng)用

許多臨床報(bào)道表明，CGF在口腔頜面外科下頜骨缺損重建、齒槽嵴增高和上頜竇提升術(shù)、種植外科領(lǐng)域的骨組織修復(fù)重建中起積極的促進(jìn)作用。Corigliano[21]報(bào)道1例36歲男性患者，╂出現(xiàn)腫脹和復(fù)發(fā)性瘺管。X光照片顯示整個(gè)牙周區(qū)存在根尖病變。患者身體健康，由于其牙周發(fā)生病變，我們決定拔除牙齒并植入修復(fù)性壓根。接著，從患者的前臂采集8份血樣，按照CGF方案用Medifuge（Silfradent，意大利）進(jìn)行分離處理。麻醉之后，小心地將牙齒拔除，避免傷及殘存的皮層。然后深入牙根尖2mm探查骨的狀況，以非常慢的速度實(shí)施截骨術(shù)，此過(guò)程不使用水。接著植入修復(fù)性牙根，拔牙后留下的種植體空間為4.7mm×15mm。隨后用纖維蛋白微粒和自體骨（截骨術(shù)過(guò)程中采集）以及凝塊的混合物填充牙根修復(fù)體和牙槽骨之間的空隙。隨后用一些交叉的纖維蛋白膜填補(bǔ)拔牙后形成的牙槽空洞，以便恢復(fù)受損的組織。此過(guò)程將保護(hù)并刺激傷口，因?yàn)樗鼘⒁浦参锔綦x，另外，由于纖維蛋白具有一定的光強(qiáng)度，能傳輸骨膜和周圍的GF釋放的愈合信號(hào)，有利于傷口愈合。手術(shù)完成后，用復(fù)合材料對(duì)牙冠進(jìn)行粘接，已達(dá)到美觀的目的。在15、30、45天對(duì)患者進(jìn)行X光檢查，60天后骨再生完成，可對(duì)患者實(shí)行牙冠修復(fù)治療。Dong-Seok等[22]將CGF用于上頜竇提升術(shù)，同時(shí)CGF隔膜用于引導(dǎo)組織再生。最近許多報(bào)道亦表明，CGF可以跟骨粉混著使用，加速骨細(xì)胞生長(zhǎng)；也可以直接鋪在縫合傷口內(nèi)，讓傷口愈合速度增加約五倍，直接填充CGF以形成骨。某男性患者來(lái)我院以“外傷后牙槽骨缺損”就診。其上頜右上┼缺失，牙槽嵴高度降低，周圍牙齦無(wú)紅腫壓痛；┼松動(dòng)I°，無(wú)叩痛，牙體伸長(zhǎng)偏頰側(cè)，咬合關(guān)系不良；右下┼缺失，牙槽嵴呈刃狀。經(jīng)X線檢查后，診斷為嚴(yán)重的垂直和水平骨重吸收。因此，決定拔牙后實(shí)施骨移植再生手術(shù)。我們使用了自體骨（從髂骨提?。〣io-oss，與CGF碎塊進(jìn)行混合，并根據(jù)覆蓋面積制CGF膜。由于骨原細(xì)胞濃縮液、生長(zhǎng)因素、細(xì)胞因子和纖維蛋白及其促使活性細(xì)胞陷入CGF的結(jié)構(gòu)，也由于Bio-oss的骨傳導(dǎo)性，CGF與自體骨、Bio-oss和血液混合后能在單一手術(shù)中完成干預(yù)工作。用CGF進(jìn)行治療的所有臨床病例中，骨和軟組織再生的情況良好，而且時(shí)間縮短一半。傷口具有極強(qiáng)的抗感染能力，降低了術(shù)后發(fā)生細(xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。膜層中添加的CGF可形成一道堅(jiān)固的屏，它使用方便，具有較強(qiáng)的粘合力和浸透性，值得臨床推廣應(yīng)用。

6問(wèn)題與展望

CGF來(lái)源于自體本身，無(wú)毒性和免疫原性，不會(huì)存在免疫排斥反應(yīng)，簡(jiǎn)單而費(fèi)用低廉的方案，基于自然生物機(jī)制。CGF具有促凝血作用，能夠促進(jìn)組織的再生，加速缺損區(qū)的愈合。CGF和新鮮的活體自體骨的混合對(duì)骨再生最為理想。這就是CGF成為目前的可靠技術(shù)的原因，CGF與其他所有血小板濃縮液（特別是PRP）的不同在于其提取技術(shù)，而且除血液外，它無(wú)需添加任何合成或催化成分即可促進(jìn)血液轉(zhuǎn)型（PRP需要添加牛凝血酶和氯化鈣）。CGF其制備工藝、生化特性、結(jié)構(gòu)、凝結(jié)物組成、纖維蛋白結(jié)構(gòu)、血小板細(xì)胞因子作用、白細(xì)胞活化作用、CGF和骨細(xì)胞間可能的相互作用、用于軟組織和骨再生的可能性，這些因素使得CGF成為一種發(fā)展迅速的生物材料，臨床應(yīng)用安全，其應(yīng)用前景應(yīng)十分廣闊。

CGF具有濃縮生長(zhǎng)因子的促生長(zhǎng)和愈合能力，有利于所有再生組織的恢復(fù)。盡管CGF具有如此多的優(yōu)點(diǎn)，但在進(jìn)行引導(dǎo)骨再生的過(guò)程中仍然需要與自體骨或骨代材料混合來(lái)加速骨再生速度，這樣做增加了術(shù)區(qū)或引起一些并發(fā)癥。若能僅用CGF而無(wú)需與自體骨或骨代材料混合來(lái)促進(jìn)成骨，將是未來(lái)的一個(gè)研究方向。CGF含有高濃度生長(zhǎng)因子的凝膠狀纖維蛋白塊，由在制造過(guò)程中血小板釋放出的高濃度生長(zhǎng)因子激活。應(yīng)用在需要再生的組織上，顯著地加速修復(fù)過(guò)程。因此，濃縮生長(zhǎng)因子（CGF）為骨組織再生和修復(fù)提供了新的思路，也為應(yīng)用骨再生方法治療頜面部骨組織缺損提供了新的理論依據(jù)。

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[收稿日期]2012-08-20 [修回日期]2012-10-09

編輯/李陽(yáng)利