Hsp90α促進(jìn)慢性難愈性創(chuàng)面愈合作用研究進(jìn)展

王芳 栗勇 　蘇映軍

慢性難愈性創(chuàng)面，簡稱慢性創(chuàng)面，系指臨床治療4～6周以上的難愈合或不愈合創(chuàng)面。多由靜脈曲張、糖尿病、動(dòng)脈炎、動(dòng)脈硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及腫瘤等引起。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有1%的人口被持續(xù)性的創(chuàng)面問題所困擾，約5%的醫(yī)療費(fèi)用花費(fèi)在創(chuàng)面修復(fù)上。在美國，每年在慢性糖尿病創(chuàng)面愈合治療方面的費(fèi)用已超過250億美元[1]。而我國，據(jù)統(tǒng)計(jì)僅糖尿病所致慢性創(chuàng)面患者就達(dá)4 000萬例。隨著人口老齡化和糖尿病、下肢靜脈潰瘍等發(fā)病率的不斷上升，難愈性創(chuàng)面的發(fā)生率也越來越高[2]；由于缺乏有效的治療，這將發(fā)展為嚴(yán)重的社會(huì)問題，因此探索創(chuàng)面愈合機(jī)制及尋找一種高效經(jīng)濟(jì)的治療方法顯得十分迫切。

正常創(chuàng)面愈合過程可大致分為三個(gè)階段：局部炎癥反應(yīng)階段、細(xì)胞增殖分化階段和組織塑形重建階段。創(chuàng)面愈合的病理生理機(jī)制是一個(gè)動(dòng)態(tài)有序且復(fù)雜的過程，但在各種系統(tǒng)或局部因素作用下，這種有序的過程被破壞，導(dǎo)致了慢性難愈創(chuàng)面的發(fā)生。造成此種破壞的因素歸納起來主要有以下五點(diǎn)：①營養(yǎng)不良；②組織灌注不良和缺血再灌注損傷；③細(xì)菌負(fù)荷、感染和壞死組織存留；④糖尿??；⑤細(xì)胞衰老。在上述因素的影響下，創(chuàng)面修復(fù)能力被削弱，而以損傷因素為主導(dǎo)，最終導(dǎo)致了難愈創(chuàng)面的形成。

1創(chuàng)面愈合的治療方法

迄今為止，在慢性難愈性創(chuàng)面的治療方面，臨床上尚缺乏非常有效的方法。19世紀(jì)初發(fā)明的封閉負(fù)壓引流技術(shù)（vacuum assisted closure， VAC）至今仍為臨床所用，但該治療方法的禁忌證廣泛，治療效果也存在較多爭議[3]；創(chuàng)面應(yīng)用敷料治療技術(shù)，目前已有各種成熟的產(chǎn)品，但其對(duì)面積大，損傷程度較深的創(chuàng)面，效果仍然有限[4]；高壓氧治療，該方法雖已被證實(shí)能夠有效改善創(chuàng)面生長環(huán)境，促進(jìn)肉芽組織的形成，然而其體積龐大，成本較高，臨床療效一般，且禁忌證較多；基因治療雖然取得了一定成績，然而多數(shù)僅局限于細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，且其安全性問題尚待研究[5]；干細(xì)胞移植雖然應(yīng)用于動(dòng)物正常創(chuàng)面可以加速愈合，但是應(yīng)用于慢性創(chuàng)面的動(dòng)物模型及臨床的效果卻并不理想且成本較高[6]；手術(shù)治療的效果并不確切，也為患者帶來較大的痛苦及負(fù)擔(dān)；而中醫(yī)復(fù)方藥具有多靶點(diǎn)多途徑的復(fù)合作用等特點(diǎn)，且價(jià)格低廉、使用方便、適用廣泛，但是其在創(chuàng)面愈合方面的作用機(jī)制卻未能得到科學(xué)深入的闡述而影響了它的推廣應(yīng)用。

過去的30多年，血清中的生長因子被普遍認(rèn)為是創(chuàng)面愈合的始動(dòng)因素：絲裂原和運(yùn)動(dòng)因子，如：表皮生長因子/轉(zhuǎn)化生子因子 （EGF/TGF ），角質(zhì)細(xì)胞生長因子（KGF），白介素-1（IL-1）等能夠促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移及上皮化而促進(jìn)創(chuàng)面愈合；血小板源性生長因子（PDGF-BB）和/或血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，促進(jìn)創(chuàng)面纖維增生和新生血管形成[7-8]。自從1989年EGF第一次被報(bào)道用于創(chuàng)面愈合臨床實(shí)驗(yàn)研究以來，許多生長因子也相繼用于創(chuàng)面愈合臨床實(shí)驗(yàn)；研究報(bào)道大部分生長因子在創(chuàng)面愈合中都有作用[9-10]，最終卻只有PDGF-BB被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床治療[11-12]。然而，研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB用于創(chuàng)面治療療效低、花費(fèi)高、副作用大等，臨床應(yīng)用受限[13]。這表明血清中的生長因子可能并不是創(chuàng)面愈合中促進(jìn)細(xì)胞遷移的來源，使得傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為生長因子是促進(jìn)創(chuàng)面愈合的主要驅(qū)動(dòng)力量受到質(zhì)疑和挑戰(zhàn)[14]。

2Hsp90α與創(chuàng)面愈合

2.1 HSP90α的發(fā)現(xiàn)：胎牛血清常被用于創(chuàng)面愈合的各種細(xì)胞培養(yǎng)，但研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的細(xì)胞并不與胎牛血清真正的融合，在創(chuàng)面中也是懸浮于血清中。通過觀察胎牛血清及人血清對(duì)創(chuàng)面愈合所需的三類細(xì)胞即角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用比較，發(fā)現(xiàn)胎牛血清能夠同等地促進(jìn)三類細(xì)胞的遷移；而人血清只能促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移，對(duì)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移沒有作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)人血清中的TGF-β3 是導(dǎo)致其不能促進(jìn)真皮細(xì)胞遷移的原因。由于血清中豐富的TGF-β3，生長因子如PDGF-BB等不能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，因此，臨床應(yīng)用中效果不如體外實(shí)驗(yàn)明顯。通過對(duì)損傷后創(chuàng)面中促使愈合的細(xì)胞及分子的研究，研究者發(fā)現(xiàn)了熱休克蛋白90α（heat shock protein 90α， HSP90α），其不僅能夠同等地促進(jìn)創(chuàng)面愈合所需三類細(xì)胞的遷移，更重要的是，即使在TGF-β3大量存在的創(chuàng)面中，HSP90α促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用并不受影響[15]。因此，HSP90α作為一個(gè)新奇的因子，成長了創(chuàng)面愈合研究領(lǐng)域的新觀念。

2.2 HSP90α及F-5的作用：體外研究表明在低氧等應(yīng)激狀態(tài)下，角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌Hsp90 至胞外，當(dāng)這些分泌的Hsp90 迅速聚集達(dá)到一個(gè)μM的濃度時(shí)，會(huì)反過來促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在小鼠背部全層創(chuàng)面使用重組的HSP90α后，其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的速度比安慰劑快約60%，是PDGF-BB的3倍；而在糖尿病小鼠背部創(chuàng)面運(yùn)用重組HSP90α后，糖尿病創(chuàng)面愈合的速度明顯優(yōu)于PDGF-BB。 HSP90α的作用在創(chuàng)面愈合過程中是必不可少的[16-18]。

從治療角度來說，蛋白中小片段的、穩(wěn)定且具有同樣效應(yīng)的短肽由于具有高度特異性以及低耗能，因此，比全長的氨基酸片段更容易通過GMP生產(chǎn)管理，故不同長度的HSP90α的截短體也由此而生。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有115個(gè)氨基酸（處于HSP90α的中間區(qū)域與鏈接區(qū)域）的截短體F-5，是目前與全長的HSP90α有同樣的促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的最小的氨基酸片段。體內(nèi)試驗(yàn)表明F-5加速創(chuàng)面愈合的速度優(yōu)于PDGF-BB， 并且主要是通過促進(jìn)上皮化來實(shí)現(xiàn)的；而對(duì)于糖尿病創(chuàng)面F-5的作用優(yōu)勢更甚于普通創(chuàng)面，也優(yōu)于PDGF-BB；F-5能夠?qū)⑻悄虿⌒∈髣?chuàng)面愈合的時(shí)間由35天縮短至14～18天，并且不是通過血管化或是創(chuàng)面的收縮完成[17]。

2.3 HSP90α及F-5的特性：HSP90α及F-5具有以下特性，因此其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用優(yōu)于生長因子 [17]：首先，HSP90α及F-5是一個(gè)公共的能動(dòng)性因子；即HSP90α及F-5能夠同等地促進(jìn)3種創(chuàng)面愈合所需的皮膚細(xì)胞（表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，真皮成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞）的遷移。皮膚受損后，首先角質(zhì)形成細(xì)胞的橫向移動(dòng)使創(chuàng)口閉合，之后成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移至基底修復(fù)受損組織及重建血管。因此，一個(gè)理想的創(chuàng)面愈合因子應(yīng)該具有募集創(chuàng)面愈合所需三類細(xì)胞的能力，由于創(chuàng)面愈合所需的三類皮膚細(xì)胞都能表達(dá)不同水平的LRP-1受體 [16]，所以，HSP90α具有此特性。而如果某個(gè)因子只能夠?qū)δ骋活惣?xì)胞起作用，其對(duì)創(chuàng)面愈合這個(gè)需要多種細(xì)胞參與的過程效果將明顯降低，如生長因子 PDGF-BB，只有成纖維細(xì)胞表面能夠表達(dá)PDGF受體，所以它只能促進(jìn)成纖維細(xì)胞的遷移。假設(shè)體外研究結(jié)果與創(chuàng)面愈合過程相類似，那就說明PDGF-BB對(duì)表皮角質(zhì)細(xì)胞的上皮化和真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管化并沒有直接的影響；其次，HSP90α及F-5是一個(gè)TGF 抵抗因子；由于細(xì)胞表面作用的受體具有選擇性，PDGF-BB不能夠抵抗創(chuàng)面中TGFβ3的抑制作用刺激成纖維細(xì)胞遷移，因此，在臨床應(yīng)用中效果并不明顯。然而即使在TGFβ3存在的情況下，HSP90α及F-5同樣能夠有效地促進(jìn)三類細(xì)胞的遷移，但具體作用機(jī)制尚待研究；第三，HSP90α及F-5是一個(gè)高糖抵抗因子，各種類型的糖尿病都是以血液循環(huán)中慢性高血糖為特征，這也是糖尿病創(chuàng)面愈合延遲的主要原因之一[19]。在創(chuàng)面愈合過程中，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）是調(diào)節(jié)HSP90α分泌的一個(gè)關(guān)鍵因子，有報(bào)道說明高糖能夠損害HIF-1α的穩(wěn)定性 [20-21]。Cheng等[17]最近研究發(fā)現(xiàn)高糖能夠抑制低氧和血清刺激成纖維細(xì)胞遷移的作用，而HSP90α及F-5不僅能夠增強(qiáng)在正常血糖水平低氧促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用，而且可以拯救高糖狀態(tài)下低氧抑制培養(yǎng)的細(xì)胞的遷移。這說明HSP90α及F-5促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面的愈合是由于越過了高糖導(dǎo)致的HIF-1α的下調(diào)并啟動(dòng)了細(xì)胞的遷移。

基于以上特性，一個(gè)新的創(chuàng)面愈合的程序被提出來，并且對(duì)驅(qū)動(dòng)表皮和真皮細(xì)胞的遷移做出了說明：在受傷之前，皮膚中的HSP90α，TGF-β3和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性是保持在最低限度的；受傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)，角質(zhì)形成細(xì)胞開始水平移動(dòng)（可能是受到急性缺氧或是血清中TGF-α的誘導(dǎo)），此時(shí)，創(chuàng)緣的成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞由于血清中TGF-β的存在并不能立即向創(chuàng)面基底移動(dòng)；遷移的角質(zhì)形成細(xì)胞開始分泌HSP90α，當(dāng)分泌的HSP90α達(dá)到100nM的閾值時(shí)[22]，即使在TGF-β存在的條件下，成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞開始從創(chuàng)緣周圍遷移至創(chuàng)基；最后角質(zhì)形成細(xì)胞完全閉合創(chuàng)面，成纖維細(xì)胞修復(fù)受損組織，血管內(nèi)皮細(xì)胞重建新的血管。組織的重建和血管的新生需要幾月才能完成，因此，角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的HSP90α替代了血清中的生長因子，可能真正的募集真皮細(xì)胞進(jìn)入創(chuàng)面的因子。

最后，Hsp90α及F-5是一個(gè)運(yùn)動(dòng)因子而非絲裂原（不能促進(jìn)細(xì)胞的增殖） [23]，這是因?yàn)椋孩俳琴|(zhì)形成細(xì)胞的遷移在皮膚損傷后立即發(fā)生，而真皮細(xì)胞的遷移至少4天以后才能被監(jiān)測 [24] ；②當(dāng)某個(gè)細(xì)胞正向著創(chuàng)面區(qū)域遷移時(shí)，這個(gè)細(xì)胞并不能同時(shí)增殖；局部受損組織所釋放的生長因子刺激表皮和真皮細(xì)胞的增殖將會(huì)被創(chuàng)面周圍的TGF-β家族細(xì)胞因子所抑制[15，17]；③在創(chuàng)面愈合過程中，細(xì)胞的遷移優(yōu)先于細(xì)胞的增殖。當(dāng)創(chuàng)緣的細(xì)胞向基底遷移時(shí)，這些細(xì)胞給它們自己及其后的細(xì)胞留下了空間，當(dāng)與前面移動(dòng)的細(xì)胞失去接觸抑制作用后，后面的這些細(xì)胞才開始增殖。細(xì)胞增殖的刺激最可能來自于周圍沒有被損傷的血管中的生長因子，因?yàn)檫@些血管中的TGF-β水平很低甚至缺乏。增殖的細(xì)胞重新填滿遷移細(xì)胞留下的空間而完成創(chuàng)面愈合過程。因此，Hsp90α的作用是盡可能快地促進(jìn)最初創(chuàng)口的關(guān)閉，預(yù)防感染及水分丟失，緩解外環(huán)境的應(yīng)激。

3結(jié)語和展望

慢性難愈性創(chuàng)面是外科常見疾病，病因繁多、病理復(fù)雜，組織再生能力差，治療困難。HSP90α的發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)的創(chuàng)面愈合觀念，為難愈性創(chuàng)面的治療提供了一個(gè)更有效、更安全的因子，對(duì)HSP90α的作用及其機(jī)制的進(jìn)一步研究，會(huì)有利于我們更深入地了解創(chuàng)面愈合的相關(guān)機(jī)制，為難愈性創(chuàng)面的治療提供新的思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Sen CK.Human skin wounds： a major and snowballing threat to public health and the economy[J].Wound Repair Regen，2009，17：763-771.

[2]Gottrup F.A specialized wound-healing center concept： importance of a multidisciplinary department structure and surgical treatment facilities in the treatment of chronic wounds [J].Am J Surg，2004，187 Suppl 5A： S38-43.

[3]Nordmyr J，Svensson S，Bjrck M，et al.Vacuum assisted wound closure in patients with lower extremity arterial disease.The experience from two tertiary referral-centres[J].Int Angiol，2009，28（1）：26-31.

[4]Helberg D，Mertens E，Halfens RJ，et al.Treatment of pressure ulcers： results of a study comparing evidence and practice[J]. Ostomy Wound Manage，2006，52（8）：60-72.

[5]Dong X，Xu J，Wang W，et al.Repair effect of diabetic ulcers with recombinant human epidermal growth factor loaded by sustained-release microspheres[J].Sci China C Life Sci，2008，51（11）：1039-44.

[6]Lin CD，Allori AC，Macklin JE，et al.Topical lineage-negative progenitor-cell therapy for diabetic wounds[J].Plast Reconstr Surg，2008，122（5）：1341-1351.

[7]Mandracchia VJ，Sanders SM，F(xiàn)rerichs JA.The use of becaplermin （rhPDGF-BB） gel for chronic nonhealing ulcers. A retrospective analysis[J].Clin Podiatr Med Surg，2001，18：189-209.

[8]Singer AJ，Clark RA.Cutaneous wound healing[J].N Engl J Med，1999，341：738-746.

[9]Werner S，Grose R.Regulation of wound healing by growth factors and cytokines[J].Physiol Rev，2003，83：835-870.

[10]Grose R，Werner S.Wound-healing studies in transgenic and knockout mice[J].Mol Biotechnol，2004，28：147-166.

[11]LeGrand EK.Preclinical promise of becaplermin （rhPDGF-BB） in wound healing[J].Am J Surg，1998，176：48S-54S.

[12]Steed DL.Clinical evaluation of recombinant human platelet-derived growth factor for the treatment of lower extremity diabetic ulcers. Diabetic Ulcer Study Group[J].J Vasc Surg，1995， 21：71-78；discussion 79-81.

[13]Nagai MK，Embil JM.Becaplermin： recombinant platelet derived growth factor， a new treatment for healing diabetic foot ulcers[J].Expert Opin Biol Ther，2002，2：211-218.

[14]Sarret Y，Woodley DT，Grigsby K，et al.Human keratinocyte locomotion： the effect of selected cytokines[J]. J Invest Dermatol，1992，98：12-16.

[15]Bandyopadhyay B，F(xiàn)an J，Guan S，et al.A "traffic control" role for TGFbeta3： orchestrating dermal and epidermal cell motility during wound healing[J].J Cell Biol，2006，172：1093-1095.

[16]Cheng CF，F(xiàn)edesco M，Guan SG，et al.TGF{alpha}-Stimulated Secretion of HSP90{alpha}： Using LRP-1/CD91 Receptor To Promote Human Skin Cell Migration Against TGF{beta}-Rich Environment In Wound Healing[J].Mol Cell Biol，2008，28：3344-3358.

[17]Cheng CF，Sahu D，Tsen F，et al."A fragment of secreted Hsp90α carries properties that enable it to accelerate effectively both acute and diabetic wound healing in mice" [J].J Clin Invest，2011，10：1172-1182.

[18]任靜，曾海峰，栗勇，等.熱休克蛋白90促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的作用研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2010，19（5）：691-699.

[19]Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications[J].Nature，2001，414：813-820.

[20]Catrina SB，Okamoto K，Pereira T，et al.Hyperglycemia regulates hypoxia-inducible factor-1alpha protein stability and function[J]. Diabetes，200453：3226-3232.

[21]Botusan IR，Sunkari VG，Savu O，et al.Stabilization of HIF-1alpha is critical to improve wound healing in diabetic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：19426-19431.

[22]Clayton A，Turkes A，Navabi H，et al.Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes[J].J Cell Sci ，2005，118：3631-3638.

[23]Li W，Li Y，Guan S，et al.Extracellular heat shock protein-90alpha： linking hypoxia to skin cell motility and wound healing[J].EMBO J，2007，26：1221-1233.

[24]Singer AJ，Clark RA.Cutaneous wound healing[J]. N Engl J Med，1999，341：738-746.

[收稿日期]2012-08-20[修回日期]2012-10-08

編輯/李陽利