草胺膦濃度對(duì)黃芩植株生長(zhǎng)和愈傷組織生長(zhǎng)分化的影響

羅翠平　李金華　楊玉穩(wěn)　曾萬(wàn)勇

摘要：通過研究除草劑草胺膦對(duì)黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）植株生長(zhǎng)和愈傷組織生長(zhǎng)分化的影響，發(fā)現(xiàn)草胺膦對(duì)黃芩植株生長(zhǎng)和愈傷組織生長(zhǎng)分化具有強(qiáng)烈的抑制作用。并在此基礎(chǔ)上找到了合適的草胺膦篩選壓，對(duì)于黃芩植株生長(zhǎng)是30 mg/L；對(duì)于黃芩愈傷組織生長(zhǎng)是3.5 mg/L；對(duì)于黃芩愈傷組織分化是3.0 mg/L。

關(guān)鍵詞：黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）；愈傷組織；除草劑；草胺膦

中圖分類號(hào)：Q949.777.6；Q813.1+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2012）20-4529-03

草胺膦（Glufosinate-ammonium）又稱草丁膦，是廣譜滅生性的有機(jī)磷類除草劑，其毒性低、活性高、用量少、環(huán)境壓力小、使用安全方便。草胺膦的活性成分為（RS）-2-氨基-4-（羥基甲氧瞵基）丁酸銨（Phosphinothricin，PPT）。PPT能通過抑制植物體內(nèi)惟一解氨毒的谷氨酰胺合成酶（GS）活性，抑制細(xì)胞內(nèi)氨的同化作用，從而導(dǎo)致氨的迅速積累，最終引起葉綠體解體、細(xì)胞死亡[1-4]。該除草劑有2種同分異構(gòu)體，其中D型不具除草劑活性，L型（L-PPT）是主要活性成分[5]。

草胺膦抗性基因bar是目前作物轉(zhuǎn)基因中用得最多的抗除草劑選擇標(biāo)記基因之一，具有快速、簡(jiǎn)便、高效等優(yōu)點(diǎn)已成功地用于大豆、小麥、水稻、玉米、大麥、甜菜、棉花、油菜等作物[6]。bar基因能消除PPT對(duì)植物體的毒害作用，它編碼草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶PAT，使乙酰輔酶A與草胺膦游離氨基結(jié)合，形成AC-PAT復(fù)合物，使草胺膦失去活性，從而使植株具有草胺膦抗性[7]。因此，對(duì)種植的含有bar基因的作物田間噴施PPT，能有效地防除雜草，減少除草劑用量及其在土壤中的殘留，生產(chǎn)成本明顯降低，國(guó)外已大面積推廣種植[8]。到目前為止，在人食用和動(dòng)物飼養(yǎng)方面尚未出現(xiàn)副作用[9]。以bar基因構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，只要在選擇培養(yǎng)基中加入一定量的除草劑，就能殺死非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，生存下來的就是含有目的基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，故能迅速、簡(jiǎn)便、有效地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，減少假陽(yáng)性植株，進(jìn)而降低了鑒定轉(zhuǎn)基因的工作量[10]。

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為唇形科黃芩屬植物，其藥用部位為干燥根，具有清熱燥濕、涼血安胎、瀉火解毒的功效，是中國(guó)傳統(tǒng)的重要大宗中藥材。對(duì)黃芩生物技術(shù)的研究有助于黃芩產(chǎn)量和品質(zhì)的提高。試驗(yàn)研究了不同濃度草胺膦對(duì)黃芩植株生長(zhǎng)和愈傷組織生長(zhǎng)分化的影響，并據(jù)此確定合適的篩選壓，為bar基因作為選擇標(biāo)記基因的黃芩基因轉(zhuǎn)化試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑黃芩種子由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所黃璐琦實(shí)驗(yàn)室提供，植株為種子無(wú)菌發(fā)芽長(zhǎng)成的黃芩無(wú)菌苗，愈傷組織為黃芩無(wú)菌苗莖段誘導(dǎo)所得。分析純草胺膦購(gòu)自Sigma公司，其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司的滬試牌分析純?cè)噭?/p>

1.1.2培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。愈傷組織繼代培養(yǎng)基：MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂粉+0.1 g/L肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；愈傷組織分化培養(yǎng)基：MS+30.0 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂粉+0.1 g/L肌醇+0.3 g/L水解酪蛋白。按試驗(yàn)方法添加不同濃度的草胺膦，高壓滅菌前調(diào)至pH 5.8～6.0，于121 ℃高壓滅菌18 min，冷凝后待用。

1.2方法

1.2.1草胺膦對(duì)植株生長(zhǎng)的影響把濃度為0、5、10、15、20、30 mg/L的草胺膦稀釋液分別涂抹在黃芩植株的葉片上，接在MS培養(yǎng)基上，將不涂草胺膦的設(shè)為對(duì)照，置于25 ℃培養(yǎng)室中，以15 h/d光照培養(yǎng)，1個(gè)月后觀察草胺膦對(duì)黃芩植株生長(zhǎng)的影響。

1.2.2草胺膦對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響選取生長(zhǎng)疏松的淡綠色黃芩愈傷組織分別接種在草胺膦濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L的繼代培養(yǎng)基上，每種濃度梯度的培養(yǎng)基接種6瓶，每瓶接入7粒愈傷組織。置于25 ℃培養(yǎng)室中，以15 h/d光照培養(yǎng)，1個(gè)月后觀察記錄愈傷組織的生長(zhǎng)、褐化和死亡情況。

1.2.3草胺膦對(duì)愈傷組織分化的影響將繼代培養(yǎng)且生長(zhǎng)疏松的淡綠色愈傷組織分別接種在草胺膦濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L的分化培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種6瓶，每瓶接入7粒愈傷組織。置于25 ℃培養(yǎng)室中，以15 h/d光照培養(yǎng)，觀察愈傷組織的分化情況。培養(yǎng)2～3周后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率。

2結(jié)果與分析

2.1草胺膦對(duì)黃芩植株生長(zhǎng)的影響

接種植株一月后觀察植物的外觀性狀。由表l可知，黃芩植株對(duì)草胺膦有一定的天然耐受性。在草胺膦濃度低于10 mg/L時(shí)，植株生長(zhǎng)基本不受影響；當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/L，葉片開始出現(xiàn)枯斑；當(dāng)草胺膦濃度達(dá)到30 mg/L，葉片才完全枯死。因此在進(jìn)行黃芩轉(zhuǎn)bar基因抗性植株的篩選時(shí)，草胺膦的濃度應(yīng)該大于30 mg/L，以避免假陽(yáng)性植株的出現(xiàn)。

2.2草胺膦對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

由表2可知，在加有除草劑草胺膦的培養(yǎng)基上，愈傷組織增殖率明顯下降，隨著除草劑濃度的升高，愈傷組織褐化率也相應(yīng)增高，大多數(shù)愈傷組織直接褐化死亡；存活的愈傷組織疏松程度逐漸降低，增殖受到影響。當(dāng)草胺膦濃度為1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的褐化率只有23.8%；當(dāng)草胺膦濃度上升至4.0 mg/L時(shí)，愈傷組織的生長(zhǎng)受到了明顯的抑制。沒有分化的愈傷組織褐化壞死。當(dāng)草胺膦濃度為3.5 mg/L時(shí)，褐化率為95.2%，是較為合適的篩選濃度。

2.3草胺膦對(duì)愈傷組織分化的影響

為了進(jìn)一步確定草胺膦對(duì)黃芩愈傷組織分化的影響，挑取各種濃度草胺膦下未褐化死亡的細(xì)胞進(jìn)行再分化，由表3可知，當(dāng)草胺膦濃度為3.0 mg/L時(shí)，尚有極少數(shù)愈傷組織能形成綠點(diǎn)，并最終形成幼苗，當(dāng)草胺膦濃度大于3.0 mg/L時(shí)，卻沒有綠點(diǎn)形成，也沒有苗形成。可見3.0 mg/L草胺膦對(duì)黃芩來說已經(jīng)是有效的抑制分化濃度了，故在進(jìn)行黃芩轉(zhuǎn)bar基因抗性愈傷組織分化的篩選時(shí)，草胺膦的濃度以3.0 mg/L較為合適。

3討論

草胺膦是一種非選擇性除草劑，具有殺草譜廣、低毒、內(nèi)吸好、活性高和環(huán)境相容性好等特點(diǎn)，也是全球第二大轉(zhuǎn)基因作物耐受除草劑，應(yīng)用前景十分廣闊[11]。不同植物對(duì)草胺膦的耐受性不同。在植物轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)過程中，需要研究目標(biāo)植物對(duì)該除草劑的耐受性。

試驗(yàn)結(jié)果顯示除草劑草胺膦對(duì)黃芩愈傷組織的抑制作用遠(yuǎn)大于對(duì)植株的作用。對(duì)愈傷組織，草胺膦濃度為3.0～3.5 mg/L可以有效抑制愈傷組織的生長(zhǎng)分化；而對(duì)黃芩植株，草胺膦的濃度則需達(dá)30 mg/L才可以完全抑制其生長(zhǎng)。因此，在進(jìn)行黃芩轉(zhuǎn)bar基因抗性植株的篩選時(shí)，草胺膦的濃度應(yīng)該大于30 mg/L。

草胺膦對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)和分化均有強(qiáng)烈的抑制作用。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，草胺膦對(duì)黃芩愈傷組織的分化比對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)具有更強(qiáng)的抑制作用，在同一種草胺膦濃度下，愈傷組織分化的褐化速率大于愈傷組織生長(zhǎng)的褐化速率；草胺膦對(duì)愈傷組織分化的篩選濃度3.0 mg/L小于愈傷組織生長(zhǎng)的濃度3.5 mg/L。

對(duì)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織，選擇培養(yǎng)時(shí)篩選臨界濃度的選擇至關(guān)重要，太高可能導(dǎo)致愈傷組織大量死亡，太小又容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此在做轉(zhuǎn)化試驗(yàn)時(shí)，可根據(jù)篩選臨界濃度和愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)來確定草胺膦的使用濃度。

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