抵抗素基因單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究

楊冰　劉忠民

[摘要] 目的 探討抵抗素基因rs34861192單核苷酸多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)系。 方法 分別測定2型糖尿病組（T2DM組）100例及正常對照組（CON組）150例空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FIN）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CH）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-CH）和抵抗素，并計算胰島素抵抗指數(shù)（IRI）；同時采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）技術(shù)對T2DM組和CON組進(jìn)行抵抗素rs34861192位點(diǎn)基因型的檢測，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行綜合分析。 結(jié)果 T2DM 患者FBG、FIN、IRI、TG、抵抗素的檢測數(shù)值[分別為（9.96±5.86） mmol/mL，（12.23±9.21） μg/mL，6.25±4.13，（2.02±1.85） mmol/mL，（7.24±3.65） ng/mL]高于健康人群的檢測數(shù)值[分別為（4.94±0.50） mmol/mL，（5.63±2.66） μg/mL，1.24±0.62，（1.33±0.74） mmol/mL，（1.44±0.93） ng/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t值 分別為8.535，4.586，4.936，3.516，15.524，P均<0.05）；T2DM組和CON組抵抗素rs34861192位點(diǎn)的基因型分布分別為AA6%、AG40%、GG54%和 AA 0.7%、AG20%、GG79.3%；抵抗素基因rs34861192位點(diǎn)的基因型分布和等位基因頻率在T2DM組和CON組間有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2值分別為20.231、19.103，P均<0.05）。 結(jié)論 抵抗素可能是T2DM的危險因子，抵抗素基因rs34861192位點(diǎn)多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)，同時可能對脂代謝有一定影響。

[關(guān)鍵詞] 抵抗素；基因多態(tài)性；2型糖尿病

[中圖分類號] R541[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B[文章編號] 1673-9701（2012）21-0048-04

人的抵抗素基因存在多種單核苷酸多態(tài)性（SNP）現(xiàn)象，而SNP與2型糖尿病間的相關(guān)性，目前并無統(tǒng)一定論，可能與研究樣本的數(shù)量、病例及位點(diǎn)的選取有關(guān)，更可能與不同種族間的糖尿病易感性及個體差異有關(guān)。我們研究抵抗素水平和抵抗素基因rs34861192位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的關(guān)系，分析此抵抗素基因是否為2型糖尿病的易感基因，為2型糖尿病的早期預(yù)測、診斷、治療及預(yù)后提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

儀器與試劑 ① 實(shí)驗儀器：質(zhì)譜檢測儀（MassARRAY Analyzer Compact），點(diǎn)樣儀（MassARRAYNanodispenser），384 孔雙頭 PCR 儀（GeneAmp PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module），6mg 384純化板（SEQUENOM 公司），STAR全自動樣本工作站和FAME全自動酶標(biāo)分析儀，羅氏cobase 411 全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。 ② 主要試劑：通用基因組DNA提取試劑盒（廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司），iPLEX PCR反應(yīng)試劑盒（SEQUENOM 公司），384-well SpectroCHIP 生物芯片（SEQUENOM 公司），HOTSTART Taq酶（SEQUENOM 公司），蝦堿性磷酸酶（SAP酶，SEQUENOM 公司），陽離子交換樹脂（SEQUENOM 公司），陽性質(zhì)控YH（深圳華大基因研究院培育的“炎黃一號”細(xì)胞株DNA），抵抗素（RapidBio Lab Calabasaa），胰島素（Abbott Japan CO，LTD），葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯（中生北控生物科技股份有限公司），高密度脂蛋白膽固醇（日本第一化學(xué)藥品株式會社），低密度脂蛋白膽固醇（DiaSys Diagnostie Systems GmbH，德賽）。

1.2 對象

（1）正常對照組（CON組）：健康體檢的150例個體，無T2DM（均檢測空腹及餐后2 h血糖），無冠心?。o主述史并且心電圖無異常），體重指數(shù)（body mass index，BMI）<25kg/m2。（2）T2DM組：新診斷的T2DM患者100例（符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)和亞太地區(qū)成人超重和（或）肥胖標(biāo)準(zhǔn)）：①糖尿病癥狀+任意時間血漿葡萄糖水平>11.1 mmol/L（200 mg/dl）；②空腹血漿葡萄糖（FPG）水平>7.0mmol/L（126 mg/dl）；③OGTT試驗中，餐后2 h血糖水平>11.1 mmol/L（200 mg/dl）。未用過胰島素，噻唑烷二酮類及其他口服降糖藥物，并排除繼發(fā)性2型糖尿病的可能。

1.3 方法

①樣本采集所有受檢者均隔夜空腹8 h以上，清晨抽靜脈血8 mL，其中一支EDTA-K2抗凝血2 mL，充分搖勻，徹底抗凝，作抵抗素單核苷酸多態(tài)性之用。兩支干燥管各注入3 mL血液，干燥管3 000 rpm/min離心15 min；一支分離血清，-20°C保存，用于抵抗素、胰島素檢測；另一支檢測基礎(chǔ)生化項目，包括空腹葡萄糖（FPG）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-CH）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-CH）。②基因分型按通用基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。由廣東省深圳市華大基因公司采用美國 SEQUENOM 公司的MassARRAY 時間飛行質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）完成對抵抗素SNP的基因分型。通過 PCR 擴(kuò)增，SAP 酶處理，延伸引物單堿基延伸，樹脂除鹽純化，芯片點(diǎn)樣，質(zhì)譜檢測等實(shí)驗步驟，最終使用 Typer 4.0 軟件分析實(shí)驗數(shù)據(jù)，獲得基因分型結(jié)果。③抵抗素的檢測 采用雙抗體夾心ELISA法。實(shí)驗儀器為STAR全自動樣本工作站和FAME全自動酶標(biāo)分析儀。④空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)IN）的檢測 采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)即化學(xué)發(fā)光微粒免疫分析。實(shí)驗儀器為羅氏cobase 411 全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），IRI=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。⑤其他生化指標(biāo)的檢測空腹葡萄糖采用葡萄糖氧化酶法測定，總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇采用終點(diǎn)法測定，低密度脂蛋白膽固醇采用選擇性抑制直接法測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SASS17.0分析軟件分析。對每組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析，F(xiàn)IN、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH、IRI和抵抗素以（x±s）表示，兩組間變量比較采用獨(dú)立樣本t檢驗， P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；變量之間相關(guān)關(guān)系分析先采用散點(diǎn)圖分析，有相關(guān)關(guān)系的趨勢變量再采用spearman進(jìn)行相關(guān)分析；研究對象的基因型和等位基因頻率直接計算，群體符合程度用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗，各組間基因型和等位基因頻率比較采用卡方檢驗，各基因型相對指標(biāo)的比較采用單因素ANOVA分析，方差不齊采用秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 T2DM組與正常對照組的臨床特征

CHOL、HDL-CH、LDL-CH采用t檢驗，F(xiàn)BG、FIN、IRI 、TG、抵抗素在兩組間的差異性采用非參數(shù)秩和檢驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2DM組與正常對照組的FBG、FIN、IRI、TG、HDL-CH及抵抗素差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），T2DM組的FBG、FIN、IRI、TG及抵抗素顯著高于對照組，HDL-CH顯著低于對照組，而兩組的CHOL、LDL-CH差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。見表1。

2.2抵抗素基因rs34861192的單核苷酸多態(tài)性

AA基因型（圖1），AG基因型（圖2），GG基因型（圖3）。

圖1 AA基因型

圖2 AG基因型

圖3GG基因型

2.3抵抗素基因rs34861192基因型在兩組人群中分布頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律

結(jié)果表明，本研究具有群體代表性。抵抗素基因rs34861192多態(tài)性的基因型頻率在T2DM組和正常對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。兩組間均以等位基因G為主，等位基因頻率的分布在兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表2。

2.4 T2DM組抵抗素各基因型間各檢測指標(biāo)水平的比較

表3顯示，F(xiàn)BG、FIN、IRI、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH及抵抗素在T2DM組內(nèi)，rs34861192的不同基因型攜帶群體間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。表4顯示T2DM患者抵抗素rs34861192位點(diǎn) AA型基因攜帶者與G等位基因攜帶者比較，兩組的FBG、FIN、IRI、TG、CHOL、HDL-CH、LDL-CH及抵抗素水平均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。抵抗素rs34861192GG型基因攜帶者CHOL、LDL-CH明顯高于AG型基因攜帶者（P ＜ 0.05），見表5。

表5 T2DM組內(nèi)各檢測指標(biāo)的水平在各基因型攜帶人群之間的比較

3討論

抵抗素是一種由脂肪細(xì)胞分泌的新激素，由Steppan等[1]在研究抗糖尿病的新藥胰島素增敏劑噻唑烷二酮衍生物的作用機(jī)制過程中，在篩選小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化基因時發(fā)現(xiàn)，因其與胰島素抵抗有關(guān)而命名為抵抗素。大量文獻(xiàn)報道，國外多數(shù)學(xué)者研究表明[1]，2型糖尿病患者有較高的抵抗素水平。近年來，國內(nèi)學(xué)者研究抵抗素與2型糖尿病之間的關(guān)系比較活躍，大多側(cè)重于臨床研究，一部分研究者認(rèn)為2型糖尿病患者血中抵抗素水平顯著高于正常組。

本研究對100例2型糖尿病患者和150例健康對照者的血清進(jìn)行相關(guān)臨床參數(shù)測定后發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病組與正常對照組間空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇、抵抗素差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0．05），而兩組的總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇差異無有統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0．05）。其中2型糖尿病組的空腹血糖、空腹胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、甘油三酯及抵抗素顯著高于對照組，呈正相關(guān)，而高密度脂蛋白膽固醇呈負(fù)相關(guān)。本研究結(jié)果與黎銀燕[2]、陳江[3]、郝小林[4]的報道一致，表明2型糖尿病的發(fā)生可能與抵抗素水平的增高有關(guān)，并且血清抵抗素與糖尿病患者的胰島素抵抗指數(shù)呈正相關(guān)，提示可能是2型糖尿病患者體內(nèi)增加的脂肪組織合成和分泌大量的抵抗素引起胰島素抵抗，使血糖水平升高，而高血糖又通過誘導(dǎo)脂肪組織對抵抗素的高表達(dá)，進(jìn)一步加重機(jī)體對胰島素抵抗，從而最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。研究也證實(shí)抵抗素與血糖水平、甘油三酯和高密度脂蛋白相關(guān)，提示抵抗素不僅參與糖代謝還參與血脂代謝，可能抵抗素對能量代謝有更廣泛的影響。所以，我們認(rèn)為抵抗素參與了胰島素抵抗過程和2型糖尿病的發(fā)病過程，并且與2型糖尿病密切相關(guān)。

抵抗素基因與T2DM的關(guān)系因多態(tài)性位點(diǎn)的部位和種類不同而有所不同，國內(nèi)外學(xué)者對此也做了廣泛研究，當(dāng)前，抵抗素基因-420多態(tài)位點(diǎn)與+299多態(tài)位點(diǎn)研究較多。NCBI數(shù)據(jù)庫上我們發(fā)現(xiàn)抵抗素基因rs34861192位點(diǎn)在國外人群中有一定突變率，而對于廣州地區(qū)人群該基因位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)研究未見文獻(xiàn)報道。本研究檢測了100例2型糖尿病患者和150例健康對照者的抵抗素基因rs34861192的三種基因型分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)SNP存在G→A的突變而呈現(xiàn)三種基因型： AA型、 AG型和GG型，在T2DM組和CON組內(nèi)該位點(diǎn)的基因型分布分別為AA6%、AG40%、GG54%和 AA 0.7%、 AG20%、GG79.3%，該位點(diǎn)的基因型頻率在T2DM和正常對照組中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0．05），并且等位基因頻率的分布在兩組間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0．05），提示抵抗素基因rs34861192多態(tài)性與T2DM發(fā)病有相關(guān)性，G等位基因可能通過活化抵抗素基因轉(zhuǎn)錄過程，增加抵抗素表達(dá)，降低胰島素敏感性，直接參與胰島素抵抗的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)在T2DM組中，GG型基因攜帶者的CHOL、LDL-CH明顯高于AG型基因攜帶者（P < 0．05），提示通過基因變異疊加作用，純合子較雜合子的變異效能明顯增強(qiáng)，對T2DM的發(fā)病可能具有更大意義，表明G等位基因參與胰島素抵抗的發(fā)生，抵抗素基因rs34861192多態(tài)性可能對脂代謝有一定影響。

目前對于抵抗素是否聯(lián)系糖尿病的主要因素尚有爭議，其作用機(jī)制有待闡明，其研究還處于動物實(shí)驗及體外試驗階段，存在大量問題有待于進(jìn)一步的研究與探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Steppan CM，Bailley ST，Bhats，et a1． The hormone resistin links obesity to diabetes[J]． Nature，2001，409（6818）：307-312．

[2]黎銀燕，周強(qiáng)，羅淼珊，等． 2型糖尿病患者血清抵抗素的檢測及其與胰島素抵抗的關(guān)系[J]． 中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2008，14（2）：145-147．

[3]陳江，姜東林，曹利民． 2型糖尿病患者血漿抵抗素和游離脂肪酸與胰島素抵抗關(guān)系研究[J]． 中國微循環(huán)，2006，10（1）：52-54．

[4]郝小林． 血清抵抗素與糖尿病的相關(guān)性研究[J]． 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010，8（8）：997-998.

（收稿日期：2012-05-24）