lncRNAs在糖尿病大鼠肺纖維化中的作用機(jī)制及利拉魯肽對(duì)其防治作用

周蕾 張雅中 房輝 秦江媛

(唐山市工人醫(yī)院內(nèi)分泌二科，河北 唐山 063000)

近年來(lái)，糖尿病(DM)肺纖維化越來(lái)越受到重視。DM肺纖維化的患者存在肺彌散功能障礙及通氣功能障礙〔1〕。長(zhǎng)鏈非編碼(lnc)RNAs參與多種器官纖維化的生物學(xué)過(guò)程，在DM肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中起重要的調(diào)控作用〔2〕。異常表達(dá)的 lncRNAs可能成為新的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察lncRNAs在DM大鼠肺組織的表達(dá)及利拉魯肽的干預(yù)作用，研究lncRNAs在DM肺纖維化中的發(fā)生作用及利拉魯肽對(duì)其新的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用6～8周齡健康SPF(無(wú)特定病原體動(dòng)物)級(jí)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠60只，體重(BW)180～220 g，由河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(使用證明編號(hào)：MY06DXK07)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 利拉魯肽注射液(北京諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)，兔抗大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1多克隆抗體、兔抗大鼠Wnt3a多克隆抗體、兔抗大鼠β-catenin多克隆抗體、SABC試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(美國(guó)Abcam公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，血糖儀及血糖檢測(cè)試紙條(德國(guó)羅氏公司)。

1.3動(dòng)物分組與處理 取雄性 SD大鼠(河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)50只。其中40只腹腔單次注射STZ 60 mg/kg誘導(dǎo)建立DM模型，對(duì)照(NC)組腹腔注射等量上述枸櫞酸緩沖液，72 h后尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖(FPG)，F(xiàn)PG≥16.7 mmol/L視為造模成功，將造模成功的30只大鼠隨機(jī)分為DM組、DM+利拉魯肽低劑量組〔400 μg/(kg ·d)，DM+LL組〕、DM+利拉魯肽高劑量組〔800 μg/(kg·d)，DM+HL組〕，治療8 w(腹腔注射利拉魯肽0.225 μg/g體重，2 次 /d)〔3〕。

1.4標(biāo)本收集與處理 在禁食12 h后，取大鼠尾末梢毛細(xì)血管全血測(cè)定FPG；天平稱重大鼠BW，均為1次/w。殺檢前1天空腹尾靜脈取血測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1c)、動(dòng)脈取血測(cè)定氧分壓(PaO2)、血氧飽和度(SaO2)及二氧化碳分壓(PaCO2)。麻醉大鼠取肺組織，標(biāo)記后放置-80℃保存。

1.5免疫組化染色 按照SP試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組TGF-β1、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)情況。免疫組化染色后半定量分析采用 Imag proplus5.0 圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度分析，棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。

1.6RT-PCR法檢測(cè)lncRNAs-H19 mRNA表達(dá) 取新鮮冰凍組織，重量約100 mg，按照Trizol一步法提取RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。取等量RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組FPG、HbA1c、BW及血?dú)獗容^ 與NC組比較，DM組FPG、HbA1c、BW差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DM+LL、DM+HL組FPG及HbA1c水平顯著低于DM組，PaO2及SaO2顯著高于DM組，PaCO2顯著低于DM組(P<0.05)，且DM+HL組血糖降低效果更明顯，見(jiàn)表1。

表1 各組血糖、HbA1c、BW及血?dú)獗容^

與NC組比較:1)P<0.05；與DM組比較:2)P<0.05；與DM+LL組比較:3)P<0.05

2.2肺組織病理學(xué)變化 蘇木素-伊紅(HE)染色顯示，與NC組比較，DM組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間質(zhì)及毛細(xì)血管基底膜增厚，部分肺泡腔萎縮甚至塌陷。見(jiàn)圖1。

2.3免疫組化結(jié)果 TGF-β1、Wnt3a、β-catenin在肺間質(zhì)中呈間斷不連續(xù)分布表達(dá)于肺間質(zhì)及血管上皮細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)。DM組TGF-β1、Wnt3a、β-catenin表達(dá)的平均光密度值顯著高于NC組(P<0.01)，DM+LL、DM+HL組顯著低于DM組(P<0.01)，DM+HL組顯著低于DM+LL組(P<0.01)，見(jiàn)表2，圖2。

表2 各組TGF-β1、Wnt3a、β-catenin比較

與NC組比較：1)P<0.01；與DM組比較：2)P<0.01；與DM+LL組比較：3)P<0.01

圖2 各組免疫組化檢測(cè)TGF-β1、Wnt3a、β-catenin在肺組織中的表達(dá)(免疫組化，×40)

2.4lncRNAs-H19在各組肺組織中mRNA表達(dá)比較 與NC組相比較，lncRNAs-H19 mRNA的表達(dá)在DM組增高2.95倍；與DM組比較，DM+LL組下降1.21倍，DM+HL組下降2.0倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

1～4：NC組、DM組、DM+LL組、DM+HL組圖3 各組肺組織中l(wèi)ncRNAs-H19 mRNA表達(dá)

3 討 論

血糖代謝在不同組織和器官有不同且復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，研究表明，DM肺纖維化是DM慢性并發(fā)癥中另一個(gè)重要的組織病變〔4〕。而lncRNAs在高糖環(huán)境下發(fā)揮關(guān)鍵作用〔5〕，研究證實(shí)lncRNAs參與了眾多病理生理學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞分化與個(gè)體發(fā)育、腫瘤的發(fā)生與遷移及器官與組織纖維化等〔6，7〕。lncRNAs-H19是最先被報(bào)道的lncRNAs 之一〔8〕，高濃度H19在器官和組織纖維化的形成中發(fā)揮了重要作用。lncRNA-H19能夠通過(guò)調(diào)控TGF-β蛋白的表達(dá)來(lái)影響其下游相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路的相關(guān)表達(dá)。TGF-β1是各個(gè)器官和組織中最重要的致纖維化因子〔9，10〕。

Wnt信號(hào)通路是一條含有高度保守的堿基序列的信號(hào)通路，由 Wnt 相關(guān)蛋白及下游的靶基因組成。研究顯示，抑制 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可降低肺纖維化的發(fā)生發(fā)展〔11〕。Wnt蛋白是細(xì)胞中重要的調(diào)控者，Wnt3a是Wnt蛋白家族一員，主要通過(guò)旁分泌、 自分泌方式釋放于胞外，并結(jié)合細(xì)胞表面受體，激活下游信號(hào)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)〔12〕。

本研究通過(guò)基因和蛋白水平驗(yàn)證，DM肺纖維化可能與lncRNAs-H19過(guò)度表達(dá)有關(guān)。同時(shí)DM大鼠肺組織TGF-β1、Wnt、β-catenin蛋白活性增加，提示lncRNAs-H19的過(guò)多表達(dá)激活TGF-β1上調(diào) Wnt/βcatenin 信號(hào)通路增加了DM肺組織纖維化的進(jìn)程。而經(jīng)過(guò)利拉魯肽治療后，lncRNAs-H19表達(dá)量下降，繼之通過(guò)TGF-β1下調(diào) Wnt/βcatenin 信號(hào)通路，并隨治療濃度的增大效果更為顯著。

綜上，DM大鼠肺組織中異常表達(dá)的 lncRNAs可能是導(dǎo)致DM肺纖維化的重要途徑，而利拉魯肽能降低其表達(dá)，且呈濃度依賴性。