當(dāng)前RNA序列比對(duì)技術(shù)的分析

侯莉　王亞?wèn)|

摘要： 新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展給DNA及RNA序列的分析帶來(lái)了機(jī)遇和挑戰(zhàn)，新一代測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)不同于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，高通量、低成本、信息量巨大的特點(diǎn)使得RNA序列的分析進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代，以往的外顯子芯片無(wú)法得到全基因組的完整信息，也無(wú)法觀測(cè)到基因融合的問(wèn)題，新一代測(cè)序技術(shù)使得對(duì)RNA序列的分析有了更深入的了解。文中簡(jiǎn)單介紹了DNA序列方法，以及當(dāng)前主要的RNA序列比對(duì)工具的基本原理，分析了各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：

中圖分類(lèi)號(hào)：TP391文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：2095-2163（2012）05-0001-04

引言

1977年，Sanger測(cè)序法？眼1？演的誕生是DNA測(cè)序技術(shù)的一個(gè)里程碑性質(zhì)的大事件。在其后的三十多年中，幾乎所有的測(cè)序技術(shù)都只是Sanger測(cè)序法的改進(jìn)，而后研究人員又將Sanger測(cè)序法的研發(fā)推進(jìn)到了自動(dòng)化的層面，從而大大提高了DNA序列的測(cè)定速度。在2004年，454、SOLiD，Illumina等測(cè)序技術(shù)的興起，給序列的測(cè)定帶來(lái)了飛躍式的變化，但隨著形態(tài)的多樣化和應(yīng)用的復(fù)雜化，由于Sanger測(cè)序法的某些缺陷，使得測(cè)序的通量和技術(shù)已經(jīng)遲滯于該領(lǐng)域的發(fā)展需求，而相對(duì)于Sanger測(cè)序法的新一代測(cè)序技術(shù)因其具有的高通量，低能耗的優(yōu)點(diǎn)，使得新一代測(cè)序技術(shù)代替Sanger測(cè)序法，而獲得廣泛的使用已成為勢(shì)所必然。而由于新一代測(cè)序技術(shù)的產(chǎn)生，RNA序列的研究也隨之發(fā)生了重大的改變。在此之前，RNA序列的測(cè)定主要是通過(guò)外顯子芯片技術(shù)。外顯子芯片可以用來(lái)測(cè)定RNA的序列信息，也可以用來(lái)分析外顯子表達(dá)量，同時(shí)也能發(fā)現(xiàn)外顯子的可變剪接等信息，但是外顯子組芯片的制作卻需要豐富的先驗(yàn)知識(shí)，并且與新一代測(cè)序技術(shù)相比，外顯子組芯片的花費(fèi)是巨大的，同時(shí)只能測(cè)定小范圍內(nèi)的序列，不能對(duì)整個(gè)基因組實(shí)施全方位的分析。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，兩種技術(shù)之間的差異也會(huì)越來(lái)越大。目前，對(duì)于RNA序列的大部分研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向了新一代測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)，但即便如此，外顯子組芯片也依然在其中發(fā)揮著獨(dú)特的重要作用。新一代測(cè)序技術(shù)的產(chǎn)生給RNA序列的分析技術(shù)也帶來(lái)了重大的改變。新一代測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)序列短、覆蓋度高，但數(shù)據(jù)量大，這給傳統(tǒng)的RNA序列分析工具設(shè)置了難題，因而應(yīng)運(yùn)而生地出現(xiàn)了多種基于新一代測(cè)序技術(shù)的RNA序列分析工具。相對(duì)于傳統(tǒng)Sanger測(cè)序法，新一代測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的序列較短，通常稱(chēng)為短序列（reads），但是新一代測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量卻要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Sanger測(cè)序法。必須正視這一問(wèn)題的積極解決，才能確保新一代測(cè)序技術(shù)的先進(jìn)性和有效性得以充分的發(fā)揮。

1 DNA序列比對(duì)工具現(xiàn)狀

對(duì)于當(dāng)前的RNA序列比對(duì)工具的研究，首先就要研究DNA序列比對(duì)工具，因?yàn)楫?dāng)前的RNA序列比對(duì)工具都是以DNA序列比對(duì)工具為基礎(chǔ)發(fā)展得來(lái)的。

新一代測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生后，曾經(jīng)應(yīng)用于外顯子芯片技術(shù)的RNA序列分析方法已經(jīng)不再適用，但是這些方法卻可留下許多有益的啟發(fā)。新一代測(cè)序技術(shù)的產(chǎn)生，給序列比對(duì)也帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)，人們都致力于研發(fā)更為有效的DNA序列比對(duì)軟件。眾所周知，只有找到新的、性能更佳的DNA序列比對(duì)方法，才能使高通量數(shù)據(jù)問(wèn)題獲得理想的解決。而RNA序列比對(duì)工具就是根據(jù)DNA序列比對(duì)軟件工具，在其基礎(chǔ)之上并根據(jù)RNA的不同性質(zhì)和各種分析需求，構(gòu)造可用于RNA序列的分析工具和分析策略。

基于新一代測(cè)序技術(shù)設(shè)計(jì)了很多DNA序列比對(duì)工具。

由于建立索引的不同，目前DNA序列比對(duì)工具主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)是用Hash表來(lái)構(gòu)建索引，另一類(lèi)是用BWT（Burrows-Wheeler Transform）來(lái)建立索引結(jié)構(gòu)，該索引結(jié)構(gòu)由于占用空間小、搜索速度快等優(yōu)點(diǎn)正被廣泛地關(guān)注和使用？眼2？演。

在高通量的序列比對(duì)中，索引是一個(gè)非常有效的機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建索引可以提高檢索速度，從而提高了整體比對(duì)速度?；贖ash表的索引構(gòu)建可以分為兩種。

一種是將參考序列（reference sequence）構(gòu)建成Hash表索引，建立索引時(shí)根據(jù)所需的短序列特性，例如長(zhǎng)度等信息，將原始的參考序列分成連續(xù)重疊的短序列，根據(jù)不同的Hash算法將這些短序列存儲(chǔ)起來(lái)，然后將實(shí)驗(yàn)得到的短序列與參考序列生成的Hash表進(jìn)行比較，從而確定短序列的比對(duì)位置。基于Hash表的全部索引結(jié)構(gòu)比對(duì)工具都可以比對(duì)有插入刪除的序列，但是時(shí)間和空間的開(kāi)銷(xiāo)卻很可觀。

另一種是將短序列（reads）數(shù)據(jù)構(gòu)建成Hash表索引，這種序列比對(duì)工具卻較少。

還有的軟件兩種方式都采用以提高比對(duì)速度?；贖ash表的索引軟件主要有Blast、Eland、MAQ、Bfast等。其中，Blast是出現(xiàn)最早的基于Hash表的索引軟件，目前有很多學(xué)者正致力于減少基于Hash表的索引比對(duì)算法所需花費(fèi)的時(shí)間和占用的空間。

基于BWT索引結(jié)構(gòu)的DNA序列比對(duì)軟件在目前的學(xué)術(shù)界較為流行。BWT變化方式比較復(fù)雜，在這里就不多做介紹了，但需要知道的是，該方式占用空間小，比對(duì)速度快?；贐WT索引結(jié)構(gòu)的DNA序列比對(duì)軟件也自然會(huì)有其無(wú)法忽視的弱點(diǎn)，即在處理插入刪除上顯然沒(méi)有基于Hash表的DNA比對(duì)軟件有效。當(dāng)基于BWT索引結(jié)構(gòu)的DNA序列比對(duì)每增加一個(gè)插入刪除位點(diǎn)，就會(huì)大大增加比對(duì)負(fù)擔(dān)，并且截至目前為止，也沒(méi)有找到這個(gè)問(wèn)題的合理解決方式。但是在不允許插入刪除的比對(duì)中，人們還是更為傾向于選擇基于BWT索引結(jié)構(gòu)的DNA序列比對(duì)軟件。基于BWT索引結(jié)構(gòu)的DNA序列比對(duì)軟件中，最具有代表性的是Bowtie和BWA。其中，Bowtie不接受插入刪除，只處理失配位點(diǎn)，所以速度更快一些；而B(niǎo)WA卻可允許少量的插入刪除，速度相對(duì)來(lái)說(shuō)就會(huì)慢一些，這主要是由處理插入刪除時(shí)消耗較多資源而引起的。

2 RNA序列比對(duì)工具分析

對(duì)于RNA序列的研究并不能完全等同于DNA序列，主要是由于RNA序列是由不連續(xù)的片段組合而成，這種不連續(xù)的片段就叫做外顯子（exon）。RNA序列雖然是以D-

NA序列為模板轉(zhuǎn)錄而來(lái)，但是與DNA序列又有很大的不同，因?yàn)椴皇撬械腄NA序列都會(huì)出現(xiàn)在成熟的RNA中，并且最后翻譯成蛋白質(zhì)，也只有外顯子才能獲得這種表達(dá)。RNA序列的轉(zhuǎn)錄及翻譯過(guò)程如圖1所示。初始轉(zhuǎn)錄成的RNA會(huì)經(jīng)過(guò)一系列的生物活動(dòng)，剪接掉內(nèi)含子，保留外顯子，并將外顯子連接在一起，同時(shí)在5端加上一個(gè)帽子，3端加上一個(gè)多聚腺苷的尾巴，最后還要經(jīng)過(guò)一系列的修飾，才能轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核外，翻譯成蛋白質(zhì)?？上攵?，將RNA序列直接比對(duì)到DNA參考基因組上，將會(huì)產(chǎn)生很大的問(wèn)題，所以需要設(shè)計(jì)適用于RNA的序列比對(duì)策略。

在DNA序列比對(duì)軟件基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的需求，產(chǎn)生了很多RNA序列分析工具。其中，以TopHat？眼3？演的應(yīng)用最為廣泛，TopHat是建立在Bowtie發(fā)展之上的，速度快，占用空間小，但是同樣也具有不允許插入刪除的缺陷。TopHat首先利用Bowtie將所有的短序列比對(duì)到參考基因組上，然后將比對(duì)上的短序列連接成外顯子區(qū)域，再將外顯子區(qū)域外延幾個(gè)bp的長(zhǎng)度，并參考已知的外顯子剪接組合，試用外顯子區(qū)域上的不同組合，將Bowtie在第一輪沒(méi)有獲得比對(duì)成功的短序列繼續(xù)比對(duì)至組合而成的參考序列上，如果確有短序列實(shí)現(xiàn)了這種有效比對(duì)，就認(rèn)定這種組合是正確的。

由于Bowtie是基于BWT索引的DNA比對(duì)工具中最早研發(fā)成功的，所以后續(xù)研究開(kāi)展得較為充分，配套工具又很豐富，知名度也相對(duì)較高，所以使用選擇者也就較多。同樣，TopHat的開(kāi)發(fā)時(shí)間也是目前較為有效的幾種RNA序列分析工具中位居首位的，因而也成為當(dāng)前流傳甚廣的分析工具。即使后面推出了更多的RNA序列分析工具，研究學(xué)者們也依然重點(diǎn)關(guān)注Bowtie和TopHat。TopHat的開(kāi)發(fā)帶動(dòng)了RNA序列比對(duì)軟件在新一代測(cè)序技術(shù)上的策略改變，由原來(lái)的主要依靠分析來(lái)解決RNA的比對(duì)，轉(zhuǎn)變?yōu)橐揽啃蛄斜旧淼男畔?lái)解決RNA序列的比對(duì)。在前文提到了RNA在轉(zhuǎn)錄后需要經(jīng)過(guò)修飾，在很大程度上與原始的DNA序列已經(jīng)有所不同，又由于TopHat不能處理插入刪除，可想而知在RNA序列比對(duì)上，TopHat還是存在著一些問(wèn)題。而且在一定限度上，TopHat還需要依靠RNA序列的先驗(yàn)知識(shí)，所以在尋找未發(fā)現(xiàn)的外顯子上面，效果不是很好。

在TopHat之后，相繼又產(chǎn)生了其他的RNA序列比對(duì)工具，例如MapSplice？眼4？演、SpliceMap？眼5？演等，這些工具也是建立在DNA比對(duì)工具基礎(chǔ)之上，構(gòu)造出的適用于mRNA的序列比對(duì)軟件。這些軟件中，MapSplice是利用Bowtie來(lái)進(jìn)行短序列比對(duì)，但是MapSplice的比對(duì)策略卻與TopHat存在著不同。首先，MapSplice將實(shí)驗(yàn)測(cè)得的短序列分成連續(xù)不重疊

的小片段，將小片段比對(duì)到參考基因組上，再利用小片段之間的聯(lián)系，找出外顯子所在位置；然后，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)特性最終確定外顯子位置以及外顯子邊緣。SpliceMap則主要是應(yīng)用Eland。首先，SpliceMap將短序列分成重疊的50bp長(zhǎng)的

小片段，將小片段的兩端25bp長(zhǎng)的序列比對(duì)到參考基因組上，而后根據(jù)兩端序列比對(duì)情況再分析外顯子區(qū)域，SpliceMap在時(shí)間和空間上與TopHat和MapSplice都要偏長(zhǎng)、偏大，并且準(zhǔn)確性還較低。另外，也還有很多其他的比對(duì)工具，但應(yīng)用卻較少，諸如SplitSeek？眼6？演，ABMapper？眼7？演等。

此外，還有一些RNA序列分析策略，雖然沒(méi)有產(chǎn)生新的算法來(lái)解決新一代測(cè)序技術(shù)之下的RNA序列比對(duì)的問(wèn)題，但是通過(guò)組合現(xiàn)有的DNA序列比對(duì)方法，產(chǎn)生了一個(gè)有效的RNA序列比對(duì)流程，使得RNA序列的比對(duì)結(jié)果更為精確。例如RUM？眼8？演和RNA-MATE？眼9？演。RUM不但包括序列比對(duì)流程，同時(shí)還包括一個(gè)RNA序列模擬生成器。RUM首先利用Bowtie將序列比對(duì)到參考基因組和轉(zhuǎn)錄組上，將剩余沒(méi)有得到比對(duì)的序列運(yùn)用BLAT再次進(jìn)行比對(duì)。但是RUM卻需要依靠現(xiàn)有的轉(zhuǎn)錄庫(kù)來(lái)分析序列，在RNA序列分析上表現(xiàn)了很大的局限性，如不能發(fā)現(xiàn)新的外顯子以及可變剪接組合信息，在新功能的發(fā)現(xiàn)上應(yīng)用空間也不大。RNA-MATE允許使用任何比對(duì)軟件。首先將所有的短序列比對(duì)到參考基因組上，再將剩余的序列分割成較短的序列，進(jìn)行比對(duì)，如此循環(huán)反復(fù)，直至達(dá)到一個(gè)設(shè)定的限度停止。

還有一類(lèi)mRNA的分析策略是，首先，將測(cè)序得到的所有短序列（reads）利用新一代測(cè)序技術(shù)的組裝工具拼裝到一起，形成長(zhǎng)的contigs，再利用簡(jiǎn)單的DNA序列比對(duì)工具，就可以將RNA序列比對(duì)到參考基因組上，而不是只能應(yīng)用基于新一代測(cè)序技術(shù)的DNA序列比對(duì)工具，才可以解決RNA序列中的比對(duì)不連續(xù)問(wèn)題。照此舉例即如Trans-ABySS？眼10？演。

RNA的種類(lèi)繁多，其生物學(xué)特性也為數(shù)眾多，所以基于不同性質(zhì)的各類(lèi)分析工具也一定會(huì)有很多。目前研究更多地集中在基因融合方面，代表性的有shortfuse、FusionMap和TophatFusion等。這些研究都是利用pair-end序列數(shù)據(jù)相對(duì)位置的改變以分析得出基因位置的相對(duì)變化，因而發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞中的基因融合現(xiàn)象。在小RNA的序列比對(duì)方面還有MicroRazerS等，小RNA由于序列較短，比對(duì)將更加困難。

綜上所述，對(duì)現(xiàn)有的基于新一代測(cè)序數(shù)據(jù)的RNA序列比對(duì)算法做以總結(jié)，結(jié)果如表1所示。

3 RNA序列分析工具分析

除了RNA序列比對(duì)軟件外，還有一些比較著名的RNA序列分析軟件，例如：Cufflinks？眼11？演和Scripture？眼12？演。這兩種工具都是首先利用TopHat進(jìn)行RNA序列比對(duì)，然后通過(guò)各自的分析策略，來(lái)推斷isoform的工具。通過(guò)將RNA的可變剪接清楚地呈現(xiàn)在人們面前，使得mRNA序列分析在整體上具備了完備性。這也是TopHat之所以受到歡迎的另一個(gè)原因。

首先，Cufflinks可使用任何版本的TopHat，將所有的pair-end序列數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因組上，然后利用組裝算法，將互有交疊的pair-end序列組裝到一起，同時(shí)依據(jù)pair-end序列的交疊信息發(fā)現(xiàn)不同的組裝路徑。而后，再根據(jù)每個(gè)位置上的序列覆蓋度，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法分析出每種isoform的比例。對(duì)全基因組中的每個(gè)可變位置都計(jì)算該比例，最后分析得出整體的isoform分布。

Scripture和Cufflink都是利用TopHat將pair-end序列比對(duì)到參考基因組上，根據(jù)pair-end序列數(shù)據(jù)的相對(duì)位置信息，將可能的外顯子組合尋找出來(lái)。兩者不同的是，Cufflink以pair-end序列為節(jié)點(diǎn)構(gòu)造出連通圖，而Scripture則是以每個(gè)堿基為節(jié)點(diǎn)構(gòu)造連通圖。Scripture首先列舉出參考序列上的堿基，在參考序列上相鄰的堿基之間有一條邊，在比對(duì)序列上相鄰的堿基之間也有一條邊，最后形成連通圖。Scripture同時(shí)利用這樣的方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上排除了錯(cuò)誤剪接位點(diǎn)，重新確定了外顯子邊界，從而根據(jù)序列的覆蓋信息來(lái)確定isoform的組份。

Cufflinks和Scripture的分析結(jié)果都可以利用基因組瀏覽器進(jìn)行觀看，更直觀地反映轉(zhuǎn)錄組信息。除了Cufflinks和Scripture之外，又新近涌現(xiàn)了一些RNA序列分析工具，例如：FDM？眼13？演。

4 結(jié)束語(yǔ)

RNA序列的分子在遺傳上具有重要的應(yīng)用，在疾病的發(fā)現(xiàn)和治療上也表現(xiàn)出了非同尋常的意義。RNA生物學(xué)性質(zhì)的多種多樣又給RNA序列的比對(duì)分析帶來(lái)了巨大的困難，目前的RNA序列比對(duì)軟件依然無(wú)法滿足已有需求，因而在RNA序列的研究和分析上，依然任重而道遠(yuǎn)。