基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基優(yōu)化

張江　李 嘯　杜浪

摘要：對(duì)基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，首先通過(guò)單因素試驗(yàn)，挑選出對(duì)菌株產(chǎn)酶有較大影響的因子及濃度范圍，再通過(guò)兩水平析因試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)確定顯著影響因子和濃度拐點(diǎn)，最后采用響應(yīng)面分析法確定得到培養(yǎng)基成分的最佳配比為：甘油 10.74 g·L-1，酵母提取物51.85 g·L-1，酵母蛋白胨10 g·L-1，磷酸氫二鉀22.82 g·L-1，磷酸二氫鉀2.85 g·L-1。與原始培養(yǎng)基生產(chǎn)水平相比，采用優(yōu)化培養(yǎng)基后，酶活提高了48.4%。

關(guān)鍵詞：基因工程；大腸桿菌；α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；最陡爬坡試驗(yàn)；響應(yīng)面設(shè)計(jì)

中圖分類(lèi)號(hào)： Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.06.018

環(huán)糊精（Cyclodextrin，簡(jiǎn)稱(chēng)CD）是由直鏈淀粉經(jīng)酶解環(huán)合后得到的由6個(gè)以上葡萄糖連結(jié)而成的環(huán)狀低聚化合物。環(huán)糊精具有獨(dú)特的環(huán)狀中空?qǐng)A筒型的立體結(jié)構(gòu)，與客體分子形成包合物后可有效地改善客體分子的物理化學(xué)性質(zhì)，因此，環(huán)糊精在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、紡織、環(huán)保、化妝品、生物技術(shù)和分析化學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌種基因工程大腸桿菌由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2試 劑酵母浸出物（FM818，簡(jiǎn)稱(chēng)YE）由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)；其它試劑均為分析純AR。

1.2方 法

1.2.1種子培養(yǎng)將斜面菌接入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37 ℃和轉(zhuǎn)速為200 r·min-1回轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)8 h。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)取5 mL種子液接入裝有100 mL培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在30 ℃和轉(zhuǎn)速為200 r·min-1回轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)36 h。

1.2.5菌體量測(cè)定取發(fā)酵液用適量蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，振蕩均勻后，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)量其光吸收值（OD600）。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基單因素試驗(yàn)與結(jié)果

本研究在碳源方面考察了甘油濃度，并考察了3種復(fù)合氮源。由表1可知，當(dāng)甘油濃度為9 g·L-1時(shí)，菌體濃度和酶活力均達(dá)到最大。YE濃度增加，對(duì)菌體濃度的增長(zhǎng)有正向促進(jìn)作用，但對(duì)酶活力增長(zhǎng)不利；同時(shí)，在有牛骨蛋白胨的條件下，酶活力顯著增加。在僅有牛骨蛋白胨的條件下，酶活力的表現(xiàn)與牛骨蛋白胨濃度呈正相關(guān)。橫向與酵母蛋白胨的影響進(jìn)行比較，牛骨蛋白胨對(duì)菌體濃度和酶活力的促進(jìn)作用顯得不足。隨著復(fù)合磷酸鹽濃度的增加，菌株產(chǎn)酶出現(xiàn)明顯的增長(zhǎng)，并在28.55 g·L-1時(shí)達(dá)到最高，說(shuō)明環(huán)境pH值對(duì)菌株產(chǎn)酶有較大影響。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)

3結(jié)論

由試驗(yàn)得知，甘油、酵母浸出物、酵母蛋白胨、復(fù)合磷酸鹽對(duì)基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶有一定影響。通過(guò)兩水平析因試驗(yàn)分析，甘油和酵母浸出物是顯著影響因子。對(duì)這二者進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，通過(guò)軟件分析，得到培養(yǎng)基成分的最佳配比為：甘油為10.74 g·L-1，酵母浸出物FM818為51.85 g·L-1，酵母蛋白胨FP101為10 g·L-1，磷酸氫二鉀為22.82 g·L-1，磷酸二氫鉀為2.85 g·L-1 。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，與原有培養(yǎng)基相比，酶活值提高了48.4%。本研究為α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有一定指導(dǎo)作用。

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