轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的研究進(jìn)展

張麗萍　查仁明　李尚偉

摘要：介紹了Bt基因及轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的作用機(jī)理，綜述了轉(zhuǎn)Bt基因水稻的研究概況，分析了轉(zhuǎn)Bt水稻的生物安全性，并展望了Bt水稻的發(fā)展趨勢(shì)，以期為Bt水稻的安全性評(píng)價(jià)及大規(guī)模商業(yè)化種植提供參考。

關(guān)鍵詞：水稻；Bt基因；轉(zhuǎn)基因；抗蟲

中圖分類號(hào)： S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2012.06.003

水稻（Oryza sativa） 是世界上最重要的糧食作物之一，全球近半數(shù)人以稻米為食。2001─2025年，世界對(duì)水稻的需求量大致每年增加1%，相當(dāng)于這一時(shí)期亞洲人口的增長(zhǎng)率。世界上水稻的種植范圍很廣，其中中國(guó)是最大的產(chǎn)稻國(guó)，其水稻產(chǎn)量占世界稻米總產(chǎn)量的1/3[1]，因此，水稻種植帶來(lái)的產(chǎn)值在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的位置。與此同時(shí)，水稻同樣也是受到害蟲侵害最為嚴(yán)重的農(nóng)作物之一[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，為害我國(guó)水稻的主要害蟲有螟蟲（稻縱卷葉螟、二化螟、三化螟）和稻飛虱，主要病害有稻瘟病、白葉枯病、紋枯病等[3]，每年因蟲害造成水稻產(chǎn)量損失約為10%[4]。在過(guò)去的幾十年中，化學(xué)防治一直是水稻害蟲防治的主要方法，但在減輕害蟲危害、提高水稻產(chǎn)量的同時(shí)也產(chǎn)生了新的問(wèn)題。化學(xué)殺蟲劑的長(zhǎng)期使用造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染、生態(tài)的失衡、生產(chǎn)成本提高、水稻品質(zhì)下降以及害蟲本身產(chǎn)生抗藥性等問(wèn)題。隨著植物分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，有大量文獻(xiàn)報(bào)道，培育自身具有高抗蟲性的水稻已成為現(xiàn)實(shí)[5-9]。

1Bt基因及轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的作用機(jī)理

1.1Bt基因的簡(jiǎn)介

Bt基因即蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt）基因，由于其具有殺蟲效果好、安全性高、高效等優(yōu)點(diǎn)，已成為現(xiàn)今世界上應(yīng)用最為廣泛和最有應(yīng)用前景的抗蟲基因。首次發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌是在1902年，發(fā)現(xiàn)該菌的學(xué)者是日本生物學(xué)家Shigetane Ishiwatari；再次分離出該桿菌是在1911年的德國(guó)蘇云金省，分離出該桿菌的學(xué)者是Ernst Berline，并將該菌命名為蘇云金芽胞桿菌[10-11]。蘇云金芽孢桿菌是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，其主要的殺蟲活性成分——?dú)⑾x晶體蛋白（insecticidal crystal proteins， ICP），也稱為δ-內(nèi)毒素，是蘇云金芽孢桿菌在芽孢形成過(guò)程中產(chǎn)生的。典型的ICP由兩部分組成，N端的活性片段和C端的結(jié)構(gòu)片段，編碼殺蟲晶體蛋白的基因通稱為Bt或Cry基因。許多ICP的氨基酸序列存在不同程度的同源性，由Crickmore等人組成的Bt基因命名委員會(huì)在1995年召開(kāi)的無(wú)脊椎動(dòng)物病理會(huì)年會(huì)上提出了以殺蟲蛋白氨基酸序列同源性為唯一標(biāo)準(zhǔn)的分類命名體系。同源性在45%以下，為第一等級(jí)，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示；同源性在45%～78%之間，為第二等級(jí)，用大寫英文字母表示；同源性在78%～95%之間，為第三等級(jí)，用小寫英文字母表示；同源性在95%以上，為第四等級(jí)，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，例如Cry1Aa1基因[12]。自1981年Schnepf等[13]首次克隆出Cry （crystal protein gene）基因以來(lái)，新的Bt基因不斷地被發(fā)現(xiàn)，截止2012年8月，Bt基因已達(dá)到73個(gè)大類，總計(jì)667個(gè)基因序列[14]。這些殺蟲晶體蛋白可作用于鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等靶標(biāo)昆蟲和線蟲，還能溶解細(xì)胞。

1.2轉(zhuǎn)Bt基因水稻的抗蟲機(jī)理

經(jīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Bt毒蛋白導(dǎo)入水稻后，一般認(rèn)為Bt毒蛋白的作用過(guò)程要經(jīng)溶解、酶解活化、與受體結(jié)合、插入和孔洞或離子通道的形成5個(gè)環(huán)節(jié)[15]。研究表明，Bt毒蛋白可溶解于pH值大于12或pH值小于9.5并加有巰基試劑的堿性溶液中[16]。鱗翅目昆蟲幼蟲中腸的pH值呈堿性，有利于Bt毒蛋白的溶解，這也是蘇云金芽孢桿菌對(duì)鱗翅目昆蟲有高效毒殺作用的原因之一。Bt毒蛋白的重要?dú)⑾x成分ICP自身沒(méi)有生物活性，又名原毒素（protoxin） ，通過(guò)昆蟲的取食可在昆蟲中腸的堿性環(huán)境中被溶解，溶解的Bt毒蛋白被中腸蛋白酶水解為毒素核心肽段，這些活力肽段能與中腸上皮的特異性受體專一性結(jié)合，進(jìn)而毒蛋白插入細(xì)胞膜中形成孔洞或離子通道，使膜的完整性遭到破壞，引起細(xì)胞滲透失衡，細(xì)胞膨脹并溶解，最終導(dǎo)致昆蟲死亡。

對(duì)Bt毒蛋白導(dǎo)致害蟲死亡的組織病理學(xué)研究表明，二化螟5齡幼蟲取食轉(zhuǎn)Bt（Cry1Ab）基因抗蟲水稻后，中腸上皮細(xì)胞中的細(xì)胞器會(huì)發(fā)生很大的變化，如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)會(huì)發(fā)生明顯變化，在病變的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹和核糖體脫落等現(xiàn)象。與對(duì)照相比，取食Bt水稻后的二化螟幼蟲腸道內(nèi)弱堿性類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的活性呈下降趨勢(shì)，而強(qiáng)堿性類胰蛋白酶的活性則呈上升趨勢(shì)[17]。在正常的稻縱卷葉螟3齡和5齡幼蟲腸道內(nèi)，中腸上皮柱狀細(xì)胞頂部的微絨毛數(shù)量比較多，細(xì)胞質(zhì)均勻， 細(xì)胞器豐富。當(dāng)這些稻縱卷葉螟幼蟲取食Bt水稻后，柱狀細(xì)胞的微絨毛有脫落現(xiàn)象，且隨著取食時(shí)間的增加，中腸上皮細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)透明化，細(xì)胞器的數(shù)量減少[18]。

2轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻概況

轉(zhuǎn)基因水稻是繼轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、棉花和油菜等之后又一個(gè)備受國(guó)際重視且發(fā)展顯著的產(chǎn)業(yè)。轉(zhuǎn)Bt基因水稻是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白基因作為外源基因?qū)胨精@得的，對(duì)鱗翅目害蟲（如稻縱卷葉螟、二化螟和三化螟等）具有良好的抗性[19]。雖然發(fā)現(xiàn)了上百種Bt基因，但是僅有很小的部分被導(dǎo)入水稻中進(jìn)行抗蟲性測(cè)定。轉(zhuǎn)Bt基因水稻最初常以Cry1A類為主，如Cry1Ab、Cry1Ac、融合基因Cry1A（b）/Cry1A（c）[20]等，現(xiàn)在Bt抗蟲水稻無(wú)論從方法上還是成果上均已取得了巨大進(jìn)展。

自20世紀(jì)80年代中期以來(lái)，研究人員運(yùn)用不同的轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了不同種類的Bt抗蟲水稻。楊虹等[5]報(bào)道了通過(guò)聚乙二醇（PEG）法將Bt基因?qū)胨?，謝道昕等[21]通過(guò)花粉管通道技術(shù)把Bt基因成功地導(dǎo)入水稻中，F(xiàn)ujimoto等[7]采用電激法將通過(guò)修飾的Cry1Ab基因?qū)刖?，首次得到了高表達(dá)Bt蛋白的水稻植株，具有良好的抗蟲性。Wünn、Ghareyazie、許新萍等研究者分別利用基因槍法將Bt基因成功地導(dǎo)入水稻中獲得了轉(zhuǎn)基因植株，且抗蟲性較好[8，22-24]；Chan、Cheng、項(xiàng)友斌等分別報(bào)道了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Bt基因?qū)胨?，獲得了可育的、抗蟲性良好的轉(zhuǎn)基因植株[9，25-28]。隨著水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷成熟，基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法成為目前轉(zhuǎn)基因水稻中常用的兩種方法。

隨著對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)單價(jià)Cry1A類抗蟲水稻植株的抗蟲譜單一，害蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因植株耐受性增強(qiáng)。為了解決這些問(wèn)題，并且使水稻能夠高抗和多抗，增強(qiáng)Bt水稻的抗蟲性，國(guó)內(nèi)外的研究者們開(kāi)始試驗(yàn)運(yùn)用除Cry1A類以外的其它基因，隨后陸續(xù)報(bào)道了運(yùn)用經(jīng)人工改造合成的Bt抗蟲基因，如用改造的Cry2A、Cry1B、Cry1C等培育的對(duì)水稻螟蟲具有不同程度抗性的水稻[29-34]。同時(shí)，協(xié)同轉(zhuǎn)化兩個(gè)或多個(gè)抗性基因的研究也在進(jìn)行，如Maqbool等[35]首次將Cry1Ac和Cry2A兩個(gè)Bt基因轉(zhuǎn)入水稻中；Bashir等[36]將Cry1Ac和Cry2A協(xié)同導(dǎo)入秈稻中，得到的轉(zhuǎn)雙價(jià)基因植株對(duì)三化螟和稻縱卷葉螟具有高抗性。衛(wèi)劍文等[32]采用基因槍法把Bt基因Cry1Ab與大豆胰蛋白酶抑制劑基因（SBTi）共同導(dǎo)入到優(yōu)良秈稻中，獲得的植株對(duì)稻縱卷葉螟的抗蟲性增強(qiáng)，李永春等[37]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把雙價(jià)抗蟲基因Cry1Ac和CpTi（豇豆胰蛋白酶抑制劑）轉(zhuǎn)入粳稻中，得到了對(duì)二化螟高毒性的植株。中國(guó)科學(xué)院Huang等[38]得到了轉(zhuǎn)Cry1Ac和經(jīng)修飾的CpTi 雙價(jià)基因水稻，對(duì)大螟、二化螟以及稻縱卷葉螟有高抗性，已進(jìn)入環(huán)境釋放階段。沈志成等[39]將融合Cry1Ab /vip3基因?qū)胨?，得到?duì)二化螟和稻縱卷葉螟抗性良好的植株，馮道榮等[40]首次運(yùn)用基因槍法把含有多個(gè)抗蟲抗病基因（Bt+pinII+bar）的載體轉(zhuǎn)入水稻，并得到了既抗蟲又抗病的植株。Maqbool[41]在2001年又研究了轉(zhuǎn)Cry1Ac+Cry2A+gna三價(jià)基因的秈稻，結(jié)果表明它們對(duì)水稻害蟲的抗性顯著，Ramesh等[42]把人工合成的Cry1Ab /Cry1Ac 融合基因和gna基因一同轉(zhuǎn)入秈稻，獲得的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鱗翅目和同翅目害蟲均表現(xiàn)出顯著抗性。

全球轉(zhuǎn)基因水稻的研究發(fā)展迅速，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最為成功的抗蟲基因是對(duì)鱗翅目害蟲有顯著控制作用的Bt基因。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻是當(dāng)前研究最為成熟和最接近實(shí)現(xiàn)商品化的轉(zhuǎn)基因水稻品種之一[43]。2000年以來(lái)，美國(guó)先后批準(zhǔn)6個(gè)抗除草劑和藥用轉(zhuǎn)基因水稻，伊朗批準(zhǔn)了1個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻商品化種植；加拿大、墨西哥、澳大利亞、哥倫比亞這4國(guó)批準(zhǔn)了轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)口，允許食用[44]。2009年，我國(guó)為轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品系‘華恢1號(hào)和‘Bt汕優(yōu)63發(fā)放了安全證書，它們是由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的高抗鱗翅目害蟲轉(zhuǎn)基因水稻?？茖W(xué)家將人工改造合成的Bt殺蟲蛋白融合基因Cry1Ab/Cry1Ac轉(zhuǎn)入水稻恢復(fù)系‘明恢63，培育出抗蟲水稻‘華恢1號(hào)。中國(guó)是世界上第三個(gè)批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因水稻的國(guó)家，將成為世界上種植轉(zhuǎn)基因水稻面積最大的國(guó)家。

3轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻的安全性

水稻作為百姓的主糧，它的產(chǎn)業(yè)發(fā)展一直備受人們的關(guān)注和重視。轉(zhuǎn)基因水稻的出現(xiàn)，可以減少水稻病害蟲的發(fā)生，減少農(nóng)藥用量和環(huán)境污染，節(jié)省投入成本，解決人類糧食緊張問(wèn)題。Bt作為外源基因?qū)胨舅a(chǎn)生的安全性問(wèn)題已成為社會(huì)廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)Bt基因水稻的安全性包括食品安全和生態(tài)安全。轉(zhuǎn)基因稻米是人們直接食用的產(chǎn)品，關(guān)系到人類的生命健康和安全。鱗翅目害蟲等靶標(biāo)昆蟲的中腸上皮細(xì)胞含有Bt蛋白的特異性受體，而人類腸道上皮細(xì)胞沒(méi)有該蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，因此Bt蛋白不會(huì)對(duì)人造成傷害。在營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)方面，轉(zhuǎn)基因水稻與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ账驹谥饕煞?、微量營(yíng)養(yǎng)成分以及抗?fàn)I養(yǎng)因子等方面都沒(méi)有生物學(xué)意義上的差異。在毒理學(xué)評(píng)價(jià)方面，轉(zhuǎn)基因稻米對(duì)大鼠進(jìn)行90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明Bt稻米對(duì)哺乳動(dòng)物是安全的[45]。

轉(zhuǎn)Bt基因水稻的生態(tài)安全性也是人類關(guān)注的問(wèn)題，轉(zhuǎn)基因水稻的種植是否會(huì)產(chǎn)生基因漂流，以及是否會(huì)對(duì)非靶標(biāo)性昆蟲、生物多樣性以及土壤環(huán)境等造成影響都需要進(jìn)一步深入研究?，F(xiàn)有的研究表明，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻對(duì)稻田生態(tài)系統(tǒng)是安全的；Bt水稻對(duì)稻田節(jié)肢動(dòng)物群落影響明顯弱于化學(xué)殺蟲劑，用Bt水稻防治害蟲比用化學(xué)殺蟲劑更有利于保持稻田生物群落的穩(wěn)定性和保護(hù)稻田中害蟲的天敵。轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)土壤微生物和酶活性有一定的影響，關(guān)于這方面的研究應(yīng)該在不同生態(tài)區(qū)開(kāi)展長(zhǎng)期的定位監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)。Bt水稻對(duì)人類、環(huán)境、生態(tài)的安全性還需要多層次、多角度地進(jìn)行深入和持久的研究。

4展望

轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻經(jīng)過(guò)20多年的發(fā)展，已碩果累累且前景廣闊。在生物技術(shù)快速發(fā)展的今天，我國(guó)作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，應(yīng)力爭(zhēng)走在轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)領(lǐng)域的最前沿。面對(duì)人口眾多的基本國(guó)情，我們?cè)诒ＷC糧食產(chǎn)量的同時(shí)要保證糧食安全。

目前，水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成熟，但距大規(guī)模運(yùn)用遺傳工程技術(shù)改良水稻品種、生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因水稻還有遙遠(yuǎn)的距離。轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻雖然在安全性研究方面已取得了一定成就，但還存在許多未知領(lǐng)域。因此，加快建立關(guān)于轉(zhuǎn)基因水稻安全性評(píng)價(jià)體系的標(biāo)準(zhǔn)是一項(xiàng)刻不容緩的工作。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻為防治害蟲提供了一條經(jīng)濟(jì)便捷的途徑，它必將帶來(lái)大規(guī)模的商品化種植，然而對(duì)它的安全性還需要從對(duì)人類、環(huán)境和生態(tài)等方面進(jìn)行長(zhǎng)期和深入的研究。

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