超高效液相色譜在中藥研究中的應(yīng)用

楊艷 陳旭冰 陳光勇 劉光明

摘 要：目的：綜述近年超高效液相色譜（UPLC）在中藥研究中的應(yīng)用。方法：查閱、分析、歸納有關(guān)文獻(xiàn)。結(jié)果：超高效液相色譜是近年來發(fā)展的以超高速度、超高分離度、超高靈敏度為特點(diǎn)的新型液相色譜技術(shù)。結(jié)論：超高效液相色譜為中藥研究提供了新手段和新思路，具有廣闊的前景。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜；UPLC；液相色譜技術(shù)；中藥；應(yīng)用

中圖分類號：R284

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-2349（2012）06-0073-03

超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）系指一種采用小顆粒填料色譜柱（粒徑小于2μm）和超高壓系統(tǒng)（壓力大于105kPa）的新型液相色譜技術(shù)，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期，因此特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究。Waters推出的ACQUITY UPLC TM超高效液相色譜系統(tǒng)在2003年3月8日~12日舉辦的匹斯堡展會上一經(jīng)露面便立即引起了轟動，這項被媒體稱為令人“比預(yù)想的還要出色”的產(chǎn)品最終獲得了2004年度的新產(chǎn)品金獎。2004年3月，Waters公司率先推出了第一臺商品化的超高效液相色譜系統(tǒng)（ACQUITY，UPLC TM）。自問世以來，超高效液相色譜發(fā)展很快，現(xiàn)已成功應(yīng)用于農(nóng)藥殘留物檢測、水質(zhì)和環(huán)境監(jiān)測、化妝品質(zhì)量控制、藥物及制劑的分析檢測和質(zhì)量控制、中藥復(fù)雜組分分析及代謝組學(xué)等領(lǐng)域［1~2］?，F(xiàn)對超高效液相色譜在中藥研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 在中藥提取工藝方面的應(yīng)用

李耿等［3］使用超高效液相色譜（UPLC），采用析因試驗(yàn)設(shè)計，考察了丹參飲片在不同加水倍數(shù)、煎煮時間、煎煮次數(shù)下的煎出液中丹酚酸B、丹參素、原兒茶醛等多種成分的含量變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明隨著煎煮時間的延長，丹參中的主要水溶性有效成分丹酚B的含量會而逐步降低；而同時，丹參素和原兒茶醛的含量則持續(xù)增加。該研究得出如下結(jié)論：丹參酮類成分水煎煮很難溶出，丹參中的丹參素和原兒茶醛主要是來源于丹參酚酸類成分在較高溫度下的逐步降解，測定或提取丹參中丹酚B等水溶性成分不宜采用長時間、高溫煎煮的方式，丹參臨床應(yīng)用時應(yīng)注意避免久煎。為今后更好利用丹參這一傳統(tǒng)中藥提供了很好的科學(xué)依據(jù)。曹悅等［4］使用UPLC，對中藥龍膽的提取工藝進(jìn)行了研究，該研究采用L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，Shimadzu C18（30×75 mm，17 μm）色譜柱，流動相為乙腈-04%磷酸（V∶V=55∶945），流速080 mL/min，檢測波長235，270 nm，柱溫為40 ℃。通過分析正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計法的結(jié)果，在使用甲醇作為溶劑、提取時間為30 min時，超聲提取和回流提取兩種方法所測定的兩個指標(biāo)性成分的含量基本一致，但考慮到回流的操作相對復(fù)雜，而且一旦超出規(guī)定的回流時間，兩類成分含量損失較大，原因是兩類成分均為裂環(huán)烯醚萜苷類化合物，受熱易分解，因此選擇了耐用性較好的超聲提取方法，并且在操作中嚴(yán)格控制溫度。

2 在中藥含量測定方面的應(yīng)用

雷萍等［5］采用UPLC檢測法，分離測定了多種蟲草產(chǎn)品中腺苷和蟲草素的含量。在最優(yōu)化條件下，以ACQUITY UPLC C18為色譜柱，流動相為乙腈和水，等度洗脫，各組分在4 min內(nèi)可基本實(shí)現(xiàn)基線分離。各組分濃度與峰面積在1~175μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性，檢測下限（S/N=3）分別為010 μg /mL和012 μg/mL。殷書梅等［6］采用超高壓高效液相檢測法，測定復(fù)方南星止痛膏中馬兜鈴酸A的含量，在Waters UPLC的高靈敏度色譜條件下，信噪比為3∶1時馬兜鈴酸A的最低檢出限01 μg；3批制劑成品及中間體中均未檢出馬兜鈴酸A；3批細(xì)辛藥材中檢出微量馬兜鈴酸A，平均含量為196μg/g，推算至每克制劑中含馬兜鈴酸A約為005μg，遠(yuǎn)低于口服制劑藥品中馬兜鈴酸A含量不得高05μg/g的標(biāo)準(zhǔn)。唐軍等［7］采用超高壓高效液相檢測法測定血栓通注射液中5種皂苷成分的含量，三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd在95 min內(nèi)即達(dá)到良好分離，最低定量限和最低檢測限可分別達(dá)05 ng和02 ng，平均回收率均大于950%。此外，超高效液相色譜在中藥含量測定方面的研究還有諸多的報道［8~19］。

3 在中藥代謝方面的應(yīng)用

薛璟等［20］采用大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)，利用UPLC法測定雷公藤甲素的量，分別研究吸收部位和藥物濃度對雷公藤甲素吸收的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4、83、20 pmol/L雷公藤甲素灌流液在各腸段的有效滲透系數(shù)和10 cm腸段吸收百分比（10 cm% ABS）依次為：十二指腸>結(jié)腸>空腸>回腸，各腸段之間無顯著性差異（P>005）。不同質(zhì)量濃度（4～20 μmol/L）的雷公藤甲素在腸道內(nèi)的吸收無顯著性差異（P>005）。潘堅揚(yáng)等［21］采用UPLC-MS/MS分析方法測定大鼠灌胃給藥和靜脈給予丹參素后不同時間點(diǎn)的血藥濃度，進(jìn)而研究丹參素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征及口服生物利用度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丹參素的口服生物利用度為953%，口服生物利用度較差，其半衰期無明顯差異。徐麗等［22］利用大鼠在體小腸灌流技術(shù)，UPLC-MASS測定大戟95%醇提物，大戟95%醇提物與大棗水提物混合溶液隨灌流時間的變化。實(shí)驗(yàn)排除了部分與解毒減毒作用無關(guān)的成分，將發(fā)生變化的成分歸類，縮小了尋找毒性成分的范圍，降低了盲目性，為更深層次的研究奠定了基礎(chǔ)。

4 在中藥指紋圖譜方面的研究

李存滿等［23~24］利用UPLC，對不同產(chǎn)地白花蛇舌草及其偽品水線草的總提物及其非強(qiáng)極性組分特征圖譜進(jìn)行相似度考察和主成分分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地白花蛇舌草原藥材包括對照藥材利用總提物特征圖譜進(jìn)行分析，盡管能得到一定的聚類效果，但并不是很明顯。而將其中的強(qiáng)極性組分有效去除，再對非強(qiáng)極性組分進(jìn)行特征圖譜統(tǒng)計分析時，不同產(chǎn)地不同品種的原藥材聚類效果很好。葉文文等［25］利用UPLC，色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（10 mm×50 mm，17μm），乙腈-水二元梯度洗脫模式，流速為01 ml?min-1，紫外檢測波長42 nm，建立了32 批不同產(chǎn)地白術(shù)樣品的UPLC指紋圖譜。白術(shù)藥材有32個共有峰，多數(shù)峰可達(dá)到較好的分離，各批次白術(shù)藥材間共有峰的相對保留時間RSD均<10%，藥材間相似度均>90%。劉少華等［26］利用超高效液相色譜對12批陜西商洛藥材基地產(chǎn)丹參藥材進(jìn)行測定，標(biāo)定共有峰，并通過國家藥典指紋圖譜相似度計算軟件中“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A 版”，計算出其相似度均在095以上。劉梅等［27］利用UPLC，建立丹參藥材中水溶性成分丹酚酸類和脂溶性成分丹參酮類的UPLC指紋圖譜方法，在15min內(nèi)得到丹參藥材水溶性和脂溶性成分的指紋圖譜，峰容量85。并采用液質(zhì)連用技術(shù)（HPLC-DAD-ESI/MSn）鑒定了其中的20個特征峰，適合于丹參藥材及其制劑的指紋圖譜研究和質(zhì)量控制。湯芳玲等［28］利用UPLC，通過檢測10 批小葉黑柴胡藥材，建立其UPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了28個共有指紋峰，根據(jù)聚類分析結(jié)果，可將藥材質(zhì)量分為2大類，8個相似度較高的藥材分為一類，相異度高的2、5號藥材分為另一類。該方法穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于小葉黑柴胡藥材的質(zhì)量控制。

5 結(jié)語

UPLC作為一種新型液相色譜技術(shù)，延伸了液相色譜的應(yīng)用范圍。UPLC以超強(qiáng)分離能力和速度、超高靈敏度、與HPLC簡單方便的方法轉(zhuǎn)換、良好的質(zhì)譜入口等特點(diǎn)為現(xiàn)代色譜分析開創(chuàng)了廣闊的前景。其進(jìn)樣體積小，分離快，溶劑消耗少，為藥物化學(xué)成分分析、藥物合成分析、中藥快速定性定量分析和體內(nèi)代謝產(chǎn)物分析，提供了一種高效、準(zhǔn)確的分析技術(shù)。充分利用UPLC的高分離效率和 MS的高靈敏度與定性功能，能快速完成眾多復(fù)雜成分的分離與鑒定。該聯(lián)用技術(shù)既可建立中藥或復(fù)方藥物指紋圖譜，又可進(jìn)行多種有效成分或指標(biāo)成分定量，還可用于體內(nèi)藥物分析。隨著藥物分析方法的發(fā)展，UPLC作為一種強(qiáng)有力的分析技術(shù)，將會在中藥研究領(lǐng)域中發(fā)揮越來越重要的作用［1］。

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（收稿日期：2011-12-27）