觀賞植物DFR基因的研究進展

符紅艷　于曉英　廖禎妮

摘要：從二氫黃酮醇4-還原酶基因結(jié)構(gòu)、基因的進化、基因的表達特性及其在基因工程方面的研究進展進行了概述和總結(jié)。

關鍵詞：DFR；基因結(jié)構(gòu)；表達特性；基因進化；基因工程

中圖分類號：S188 文獻標識碼：ADOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.06.004

1DFR基因在觀賞植物的呈色及花色素苷合成途徑中的作用

色彩是觀賞植物表現(xiàn)出來的一個重要特性，花、葉、果實等這些觀賞器官的顏色都決定著觀賞植物的觀賞價值和商業(yè)價值。在高等植物中，花色和果色主要由類黃酮、類胡蘿卜素和甜菜色素三大色素所決定[1]。而類黃酮中的花色素苷則是影響花色的主要色素，賦予花和果實除綠色之外的其他顏色，如紅色、粉紅色、紫羅蘭色和藍色等，特定條件下還出現(xiàn)黑色[2]。

二氫黃酮醇4-還原酶(Dihydroflavonol 4-Reductase，DFR)在不同花色形成過程中發(fā)揮了關鍵作用，它是把二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ胤磻牡谝粋€酶[3]。類黃酮類色素的生物合成已經(jīng)較為清楚[3-4](圖1)。由苯丙氨酸到花青素的合成可以分為3個階段:第一階段由苯丙氨酸到香豆酰CoA,這是許多次生代謝都共有的;第二階段是由香豆酰CoA到二氫黃酮醇,這是類黃酮代謝的關鍵反應,它合成花青素和其它黃酮物質(zhì)；第三階段是各種花色素苷的合成。

在花色素苷合成的途徑中，DFR對花色素苷的最終形成起決定性作用。DFR是花色素苷生物合成中的關鍵性最初是在紫羅蘭的一個突變體中發(fā)現(xiàn)的[5]。其反應需要NADPH參與。DFR依賴DHK、DHQ和DHM 3種底物，它們在結(jié)構(gòu)上非常相似，只在B苯環(huán)上的輕基數(shù)目上不同。DFR能利用這3種底物，是因為F3′H和F3′5′H兩種輕化酶的活性。F3′H能使DHK轉(zhuǎn)化成DHQ。F3′5′H則可以讓DHK轉(zhuǎn)化為DHM，還可以使DHQ轉(zhuǎn)化為DHM[6]。這是因為不同物種的DFR對底物選擇性不同，合成了不同的花色素，就呈現(xiàn)出各異的花色[7]。就如矮牽牛的DFR缺乏還原底物DHK活性，所以其花瓣缺少橙色；而大丁草DFR能還原DHK，其花瓣就能產(chǎn)生橙色[8]。

2二氫黃酮醇4-還原酶基因結(jié)構(gòu)

1985年，OReiny C等[9]采用轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)，首次從玉米和金魚草中分離出了DFR基因，1989年Beld等[10]用金魚草DFR基因作為探針分離出了矮牽牛DFR基因，相關研究者陸續(xù)采用同源克隆的方法已在多觀賞種植物中分離出了DFR基因（表1）?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，DFR基因在植物的基因組中一般為單拷貝[5]，其為多基因家族的例子很少。裂葉牽牛（Ipomoeanil）與圓葉牽牛（I.purpurea）的基因組序列包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，金魚草、擬南芥與矮牽牛一樣的DFR基因也包含了5個內(nèi)含子；內(nèi)含子的剪切位點均符合GT－AG法則[11]。陳大志等[12]在研究唇形亞綱植物DFR基因時表明，DFR表現(xiàn)為親水性。唇形亞綱植物DFR基因的空間結(jié)構(gòu)分為兩個部分為松散C-末端和致密球狀結(jié)構(gòu)。DFR與NADPH輔助因子的底物結(jié)合區(qū)域都在致密球狀結(jié)構(gòu)中。唇形亞綱植物DFR都含有一個NADB_Rossmann superfamily保守結(jié)構(gòu)域。

DFR為脫氫酶類，此類酶主要的特點是至少含有2個結(jié)構(gòu)域即，第一個結(jié)構(gòu)域—輔酶的結(jié)合位點及第二個結(jié)構(gòu)域—催化作用位點。不同物種其DFR氨基酸序列存在一定區(qū)域的同源性，如在DFR與NADP結(jié)合位點，‘VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY，為高度保守區(qū)[13]。DFR對不同底物的結(jié)合由其分子中底物結(jié)合區(qū)氨基酸序列所決定的，這個序列在不同物種中也高度保守。結(jié)合區(qū)中134位與145位的氨基酸殘基就直接影響酶的底物特異性，且大多數(shù)物種在134位含天冬氨酸殘基(D)或是天冬酞胺殘基(N)[14]。在矮牽牛以外的其他以DHK為底物的雙子葉植物中，就存在高度保守的145位谷氨酸殘基(E) [2]。祝婷等[15]利用DNAMAN軟件對苦蕎FtDFR和甜蕎FeDFR推導的氨基酸序列及同源蛋白進行多序列比對，其發(fā)現(xiàn)在DFR蛋白質(zhì)序列中有一個NADP(H)結(jié)合保守區(qū)域VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY，且存在一個底物特異性結(jié)合的保守區(qū)域TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV。

3二氫黃酮醇4-還原酶基因進化

DFR依照第134位氨基酸殘基的不同將其可分為3類[16]：第一類為Asn型DFR，在絕大多種植物DFR中第134位氨基酸殘基為天冬酰胺殘基(N);第二類為Asp型DFR，其在134位上存在一個天冬氨酸殘基(D)，此類DFR不能有效地將DHK還原成無色花葵素，如矮牽牛、番茄和三花龍膽;第三類是DFR的第134位氨基酸殘基既不是天冬酰胺和天冬氨酸，又稱為非Asn/Asp型DFR，蔓越橘就在此位點為擷氨酸殘基(V)。Asn型的DFR在植物界中分布較廣，單子葉植物均為Asn型DFR。Asp型DFR僅分布在部分雙子葉植物中，而非Asn/Asp型DFR只在少數(shù)植物中存在。但由于Asp型和非Asn/Asp型DFR的數(shù)量有限，且在進化上分布較遠，由此可推測Asp型和非Asn/Asp型DFR有可能由Asn型進化來的[7]。

孫桂平[17]等在對垂絲海棠花色素苷合成基因MhDFR的克隆時指出其MhDFR和蘋果(Malus domestica)、葡萄(Vitis vinifera)、西洋梨(Pyrus communis)等樹種的DFR序列均有較高的同源性，含有其家族同源基因相似的中央編碼區(qū)，且具有典型的DFR基因蛋白功能結(jié)構(gòu)域，屬于短鏈的脫氫酶及還原酶(SDR)家族。從序列比對結(jié)果的來看，不同樹種來源中的DFR具有較高的同源性，說明DFR在基因進化過程中高度保守，同時也暗示DFR在花色素形成過程中起到重要的作用。據(jù)報道，植物DFR在第136位氨基酸的變化直接影響其對底物選擇的特異性[18]。在雙子葉植物中，存在于第136位是天冬氨酸(ASP，D)、天冬酞胺(Asn，N)和非D加型DFR[16]。陳大志[12]在研究唇形亞綱植物時發(fā)現(xiàn)其DFR基因間保持著很高的同源性和一致性，存在一定的密碼子偏好性，唇形亞綱植物的DFR基因均在各自的有機體中高表達。在唇形亞綱植物DFR基因地進化過程中主要經(jīng)歷了純化選擇性壓力，且在進化分支中經(jīng)歷了相同的選擇性壓力。唇形亞綱植物DFR基因的進化速率不存在顯著差異，進化的平均速率為(0.70±0.21) ×l0-9替換數(shù)/位點/年。祁銀燕等[19]通過聚類分析結(jié)果表明，單子葉植物風信子的DFR基因，和單子葉植物的親緣關系較近。系統(tǒng)進化樹體現(xiàn)了DFR在單子葉和雙子葉植物之間的區(qū)別，從風信子中克隆出來的DFR基因先與鳶尾等單子葉植物聚類合并，最后才和雙子葉植物聚類，表明不同物種DFR基因進化程度不同。也有人認為，DFR的趨異可能發(fā)生于單子葉和雙子葉植物的趨異之后[20]。

4二氫黃酮醇4-還原酶基因的表達特性

4.1表達的部位

不同物種的DFR基因在不同部位與不同發(fā)育期的時空表達特性也有所不同[15]。但DFR在不同品種間的表達體現(xiàn)出空間專一性調(diào)控，其在花瓣中的表達與CHS和CHI相協(xié)調(diào)[21]。花序發(fā)育過程中, DFR基因在花器官、花冠內(nèi)和花類型的表達依照品種花色素苷顏色而變化[22]。

Nakatsuka等[23]在研究亞洲百合“Montreux”時發(fā)現(xiàn)，DFR在著色的器官如被片、花絲、花藥、雌蕊和紅色的鱗片中大量表達，而在未著色的莖、葉子和白色的鱗片中均不表達，且DFR的表達量隨花的生長發(fā)育而增加，在開花期最大量的表達。可見，DFR只在花色苷著色的器官中表達，其基因的表達量與花色苷的產(chǎn)生相一致[24]。Nakatsuka還在對雜種百合花研究發(fā)現(xiàn)LHDFR基因控制花器官表達模式，花瓣花青素積累伴隨著LHCHSA及LHDFR的表達，CHS和DFR對花被片及花瓣顏色的控制是獨立的。James等[25]通過探針標記技術(shù)分離克隆了蔓越橘DFR基因且在煙草中成功的表達，且僅在花色素苷著色的器官中表達，與花色素苷的產(chǎn)生相協(xié)調(diào)[23]。劉娟等[1]認為，DFR基因表達隨著花瓣組織的著色進行，其時空表達特性基本上和花朵的著色模式相一致。

Murray等[26]研究發(fā)現(xiàn)，幼年期的常春藤在莖和葉柄中都有花色苷積累，此時DFR活性較高；到了成熟階段，雖體內(nèi)積累了大量的二氫黃酮醇，卻不能合成花色苷，檢測后發(fā)現(xiàn)此時DFR沒有活性。郭晉雅等[24]的研究結(jié)果顯示，在不同生長時期及同一生長時期的各品種甘薯中，不同器官的DFR活性與其花色苷含量呈顯著線性正相關。文樵夫等[27]研究表明DFR在所有觀賞海棠葉片中均有表達，與葉色密切相關，葉色越紅的品種，其花色苷含量越高。矮牽牛的DFR-A基因在花冠、花藥及種子中表達量很高，在胚珠與莖中的表達量相對較少[28]。許志茹等[29]研究表明地被菊DgDFR1和DgDFR2在‘神韻和‘繁星粉兩品種的根、莖、葉中均不表達，但在花中特異性表達。郭鳳丹等[30]的研究發(fā)現(xiàn)，花生DFR在花青素積累較多的果針中大量表達，在黑色種皮種子、深紅色種皮種子中的表達量明顯高于粉紅色和白色種皮種子中的表達量。周琳等[31]通過實時熒光定量PCR分析表明，牡丹DFR基因在花色素大量積累的花瓣中表達量最高，其次是萼片和雄蕊，再次是葉片，在心皮中表達量最低。

在日本裂葉牽牛、矮牽牛和非洲菊中，同一器官僅有一個DFR基因表達，其表達模式十分復雜[11]。矮牽牛中雖有3個DFR基因拷貝（DFRA，DFRB，DFRC），但只有DFRA在花器官中表達[32]；日本裂葉牽牛中也有3個DFR基因拷貝（DFRA，DFRB，DFRC），但僅在DFRB突變發(fā)生時會抑制花中的色素合成途徑[33]；同時Southern雜交分析表明非洲菊存在多個DFR基因拷貝，但僅GDFR1有催化活性并在花中表達，對其啟動子分析表明，它的表達受復雜的調(diào)控[34]。百脈根(Lotus japonicus)的基因組中有5個DFR基因,并能產(chǎn)生6個具有功能的mRNA，具有不同的組織特異性 [5]，其DFR1在花、豆莢、莖、根、葉和結(jié)節(jié)中都表達；DFR2則在除葉以外的其它器官表達；DFR3只在葉和莖中表達；DFR4和DFR5不在結(jié)節(jié)中表達外，且在根中表達較弱[35]。

4.2影響表達的因素

影響DFR基因表達的因素很多，包括環(huán)境因子對的影響，外源化學物質(zhì)對的影響等等。DFR和CHS都是光調(diào)節(jié)酶，光的誘導可以提高這些酶的活性，從而促進花色素苷的積累[36]。矮牽?；ㄔ诎蹬囵B(yǎng)下的幼蕾期，花色素苷的積累以及CHS和DFR基因的表達均受到明顯的限制，隨著光強度的增加，花色素苷的積累和相關基因的表達即受到促進[37]。溫度對DFR基因的轉(zhuǎn)錄也有一定的影響，張學英等[38]指出39/18 ℃(晝/夜)處理玫瑰花3 d，花色素苷含量明顯呈下降趨勢，CHS和DFR基因轉(zhuǎn)錄水平也有所下降。Hasegawa[39]研究了低溫誘導下水芹花青素積累及相關基因的表達，表明DFR基因表達特異地受低溫的影響，DFR與PAL和CHS表達機制都不同，在低溫脅迫中DFR的表達為關鍵的一步。pH值也影響著DFR的表達，如在矮牽牛中，bHLH類轉(zhuǎn)錄因子ANI的突變導致了細胞液泡的pH值升高，并影響了DFR基因的表達，進而抑制了花色素普的合成[40]。

外源化學物質(zhì)對的影響體現(xiàn)在蔗糖還可以提高DFR和ANS酶的活性[41]。在低Ca2+濃度下DFR基因的表達量不高，隨著Ca2+濃度的增加DFR基因的表達量也隨之升高[42]。

5DFR基因在花色改良上的應用

世界上第一例通過基因工程技術(shù)改變花色的實例是在1987年，Meyer等[43]將玉米DFR的基因?qū)氚珷颗c01突變體，其花色由白色變?yōu)榈u紅色。之后，荷蘭S&G種子公司將玉米的DFR基因?qū)肓税珷颗?再將轉(zhuǎn)基因植株自交,培育出了橙色矮牽牛[44]。Tanaka等[45]把從玫瑰花瓣中克隆的DFR基因，轉(zhuǎn)入淡粉紅色的矮牽牛中，產(chǎn)生了矮牽牛所缺乏的橙紅色的花葵素。Johnson等[14]在研究蘭屬植物的花時，將蘭屬DFR基因轉(zhuǎn)入矮牽牛品系中，結(jié)果表明蘭屬的DFR不能有效還原DHK，從而導致花葵素的缺乏。

由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能的研究領域，同時作為一種有效修飾花色的新方法被應用到了觀賞植物的呈色調(diào)控中[46]。孫穎等[47]在夏瑾上引入反義DFR基因誘導黃酮累積，因為共顯色效應而產(chǎn)生了藍色花卉。2000年，Meyer等[48]將反義DFR基因?qū)胨{豬耳中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系的花冠花色素苷含量均有減少，產(chǎn)生了多種新花色圖案，且冠檐中的花色素含量的減少程度比冠筒大，由于轉(zhuǎn)化植株中DFR基因的鈍化，造成了大量黃酮和黃酮醇物質(zhì)的積累，致使藍豬耳的花色顯得更藍。One等[49]揭示了通過調(diào)控橙酮生物合成途徑導致夏瑾產(chǎn)生黃花。抑制內(nèi)源F3′H或DFR基因，過表達金魚草C4′GT（查爾酮4′－O－葡糖基轉(zhuǎn)移酶）基因引起金色草素6－O－葡萄糖苷在花瓣上的大量積累。在藍眼菊的研究中，通過RNAi抑制F3′H并且導入非洲菊DFR基因，也獲得了天竺葵色素積累的結(jié)果[50]。

此外，通過控制羥基化模式，能表達翠雀素型花青素的轉(zhuǎn)基因康乃馨和玫瑰也獲得成功，已被商業(yè)化生產(chǎn)[51-52]。導入外源DFR和F3′5′H基因也是產(chǎn)生翠雀素的前提條件。目前在日本商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因藍色玫瑰含有外源DFR基因，并且同時過表達三色堇F3′5′H和夏瑾花青素5－?；D(zhuǎn)移酶基因。近年來，導入翠雀素的紫羅蘭和菊花等品種也陸續(xù)問世[47]。澳大利亞Florigene公司和日本Sandory公司的研究人員將矮牽牛F3′ 5′ H和DFR基因?qū)肴狈FR的白色香石竹，培育出紫色品種“Moon-dust”，現(xiàn)已在2個國家銷售，成為第一例上市的轉(zhuǎn)基因花卉[53]。

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