有關(guān)“單克隆抗體制備”的幾點(diǎn)釋疑

李穎

摘要：“單克隆抗體的制備”是高中生物選修三的一個(gè)難點(diǎn)。筆者通過(guò)深挖教材，對(duì)教材中沒有解釋清楚的幾個(gè)疑點(diǎn)做了闡釋，同時(shí)構(gòu)建了邏輯更為合理的單克隆抗體流程圖供大家參考。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)慰寺】贵w；雜交瘤細(xì)胞；選擇性培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2012）09-0204-02

“單克隆抗體的制備”是高中生物人教版選修3專題2第二節(jié)“動(dòng)物細(xì)胞工程”一節(jié)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。內(nèi)容相對(duì)復(fù)雜、抽象，加上教材對(duì)部分環(huán)節(jié)處理得很簡(jiǎn)練，學(xué)生理解起來(lái)難度很大，難免產(chǎn)生這樣或那樣的疑問(wèn)。筆者通過(guò)對(duì)教材的研究及教學(xué)的反思，將教學(xué)過(guò)程中學(xué)生提出的問(wèn)題及課本中應(yīng)挖掘和拓展的知識(shí)總結(jié)如下：

1 教材中需要挖掘和總結(jié)的知識(shí)

1.1什么是單克隆抗體和多克隆抗體。單克隆抗體（monoclonal antibody）：是指利用一個(gè)B淋巴細(xì)胞進(jìn)行無(wú)性增殖，產(chǎn)生大量的同一種類的B淋巴細(xì)胞群，再由這個(gè)細(xì)胞群產(chǎn)生出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體。多克隆抗體（polyclonal antibody）：當(dāng)肌體受到抗原刺激后，可產(chǎn)生新的抗體?？乖肿拥臎Q定簇直接決定了抗體的特異性的存在，同時(shí)也內(nèi)含著大量的原決定簇。所以，經(jīng)過(guò)他免疫所纏身的抗血清實(shí)就是多種抗體的混合物，我們習(xí)慣性地把這個(gè)稱為克隆抗體。

1.2單克隆抗體制備的原理是什么。動(dòng)物在免疫反應(yīng)的過(guò)程中，各種B淋巴細(xì)胞都可以分泌出特有的特異性抗體，為了大量地獲得，就必須最大限度地增加增殖這些單一抗體。而且眾所周知，B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生一種能力，叫做單一抗體，但是他的局限是不能夠完成體外增殖；但是骨髓瘤細(xì)胞卻可以在外界限定條件下被無(wú)限地增殖，更為可怕的是它是癌細(xì)胞，還好沒有產(chǎn)生抗體的能力。所以大膽試驗(yàn)，把二者合為一體進(jìn)行細(xì)胞融合，產(chǎn)生新細(xì)胞，這種細(xì)胞兼具雙特性——在特定條件下，可以產(chǎn)生大量某種特異抗體，卻不會(huì)出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。

1.3從小鼠脾臟中獲取的B淋巴細(xì)胞是指哪類細(xì)胞？是否是一種淋巴細(xì)胞？從小鼠脾臟中取出的能產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞指的是漿細(xì)胞（效應(yīng)B細(xì)胞）。但是在在免疫的實(shí)際操作中，我們采用的方法是連續(xù)注射抗原，由于每一次注射的抗原不同，而一種抗原特定簇只能形成相對(duì)應(yīng)的一種B淋巴細(xì)胞。所以，提取的B淋巴細(xì)胞也有著各不相同的特異性。

1.4B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后獲得哪些類型細(xì)胞。在制備雜交瘤細(xì)胞這一步驟中，培養(yǎng)液中共含5種主要細(xì)胞，即未融合的B淋巴細(xì)胞、未融合的骨髓瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞-B淋巴細(xì)胞融合細(xì)胞、骨髓瘤-骨髓瘤融合細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞-骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞）。

2 教材中相關(guān)知識(shí)的拓展

2.1如何利用特定的選擇性培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞。第一次篩選的關(guān)鍵在于細(xì)胞融合后，如何選擇培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞。我們有兩種方法可以合成細(xì)胞中的DNA。第一條途徑“D途徑”，也就是用氨基蝶呤來(lái)直接阻斷DNA的合成的一種極端方法。第二條途徑適合使用在緊急情況下，也被叫做“S途徑”。也正是以此為根據(jù)，我們?cè)谂渲肏AT選擇性培養(yǎng)液的時(shí)候會(huì)定量放入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。這其中的未融合的B淋巴細(xì)胞和兩個(gè)B淋巴細(xì)胞融合的“D途徑”氨基蝶呤阻斷，導(dǎo)致其短期死亡。就算“S途徑”正常，也因其缺乏體外培養(yǎng)增殖的能力而死亡。再說(shuō)骨髓瘤細(xì)胞及其自身的融合細(xì)胞，屬于HGPRT細(xì)胞，自身沒有“S途徑”，同時(shí)“D途徑”又被阻斷，導(dǎo)致HAT在培養(yǎng)液中迅速死亡。只剩下雜交瘤細(xì)胞，在擁有“S途徑”的同時(shí)，也可以在培養(yǎng)液中長(zhǎng)期增殖，所以能選擇存活下來(lái)然后不斷增殖并不稀奇。

2.2雜交瘤細(xì)胞的抗體檢測(cè)及克隆化培養(yǎng)過(guò)程解析。雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)就是：在融合后的細(xì)胞經(jīng)過(guò)選擇性培養(yǎng)后，那些能夠存活下來(lái)的細(xì)胞就是雜交瘤細(xì)胞。然后用“有限稀釋法”來(lái)選擇出這些雜交瘤細(xì)胞是否是能分泌出所需抗體的類型。接下來(lái)就是培養(yǎng)過(guò)程，先將雜交瘤細(xì)胞稀釋，嚴(yán)格限制每空細(xì)胞不能超過(guò)一個(gè)，用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)，并觀察其不斷地增殖。過(guò)一段時(shí)間觀察是否出現(xiàn)陽(yáng)性孔，陽(yáng)性孔是各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體（常用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法），那些上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔。由于陽(yáng)性孔自身的特性所限，必須進(jìn)行3到4次的有限稀釋才能夠保證每個(gè)培養(yǎng)孔的增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。至此，克隆化培養(yǎng)才算結(jié)束。

2.3為什么獲得預(yù)定的雜交瘤細(xì)胞后，要盡快進(jìn)行單克隆抗體制備。實(shí)驗(yàn)中，融合細(xì)胞會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)發(fā)生污染、染色體丟失以及細(xì)胞死亡率增加等現(xiàn)象，因此，一旦獲得能產(chǎn)生預(yù)定特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，就應(yīng)盡早地進(jìn)行單克隆抗體制備。

2.4單克隆抗體獲取的途徑是什么。大量生產(chǎn)單克隆抗體的方法可分為體內(nèi)和體外兩大類，目前以體內(nèi)法為主。

體外培養(yǎng)法：將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，雜交瘤細(xì)胞合成并分泌單克隆抗體，收集上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。

體內(nèi)培養(yǎng)法：往小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞，雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。用注射器抽取腹水，提取單克隆抗體。

2.5獲得的單克隆抗體為什么還要進(jìn)一步純化。無(wú)論是體內(nèi)還是體外培養(yǎng)獲得的單克隆抗體都必須進(jìn)一步純化，因?yàn)閱慰寺】贵w上仍有可能帶有鼠的抗原決定簇，患者有可能產(chǎn)生針對(duì)于單克隆抗體的抗體，出現(xiàn)交叉反應(yīng)。單抗純化有三種比較常見技術(shù)：1.DEAE離子交換層析柱；2.凝膠過(guò)濾法；3.親和層析法。我們應(yīng)該根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的實(shí)際情況來(lái)選擇合適的方法，而不是按照課本，一步步照搬而來(lái)。

為了方便讀者更好地理解文中的內(nèi)容，筆者繪制了單克隆抗體的制備流程圖，僅供參考。

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