卡鉑聯(lián)合多西他賽化療對(duì)宮頸癌組織中survivin蛋白表達(dá)的影響

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（西安710004） 薛 翔 韓紅芳 段 釗 公丕軍

宮頸癌為婦科最常見(jiàn)的腫瘤，近年的發(fā)病有明顯的年輕化趨勢(shì)，過(guò)去宮頸癌治療以手術(shù)和放療為主，但對(duì)部分有生育要求的病人，手術(shù)和放療均存在很大的局限［1］；隨著新輔助化療的提出，近年來(lái)，宮頸癌的化療取得了較好的治療效果；宮頸癌的化療方案有多種，卡鉑聯(lián)合多西他賽為最近提出的一種方案，我們通過(guò)檢測(cè)survivin表達(dá)對(duì)該方案的作用機(jī)理進(jìn)行研究。

材料與方法

1 材 料 選擇我院2009年1月至2011年6月行靜脈＋手術(shù)治療且臨床分期為Ⅰb～Ⅱb期宮頸癌患者60例。年齡23～62歲，平均44.5歲，其中≤40歲15例。鱗癌55例，腺癌5例。

2 治療方法 所有病人入院后，兩名副主任醫(yī)師以上醫(yī)師對(duì)病人進(jìn)行臨床分期?；熐叭』顧z，活檢癌腫放入－80℃冰箱保存。所有患者均采用靜脈化療方案：多西他賽75mg/m2溶于0.9%氯化鈉液250ml中，第1天靜脈滴注1h；卡鉑350mg/m2，用生理鹽水溶解后，再稀釋至500ml，靜脈滴注，滴注時(shí)間不應(yīng)少于1h，滴完后需繼續(xù)點(diǎn)滴輸液1000ml以上，第1天化療，然后水化2d，間隔3周再次重復(fù)。所有病例均化療3個(gè)療程后，根據(jù)腫塊縮小情況選擇手術(shù)或者放療。

3 RT－PCR半定量分析 引物均由上海生物公司合成。survivin引物為：上游引物：5’－AGGCTGGCTTCATCCACT－3’， 下 游 引 物：5’－CACCAAGGGTTAATTCTTCA－3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度180bp。上游 引 物：5’－CCAGAGCAAGAGAGGCATCC－3’，下游引物：5’－CCGTGGTGGTGA AGC TGT AG－3，總長(zhǎng)度437bp。組織總RNA提取按照Trizol（Qiagen，USA）劑盒說(shuō)明書的操作步驟，按1×107/ml Trizol的比例提取組織總RNA；按照翻轉(zhuǎn)錄試劑盒（MBI，USA）說(shuō)明書在20μl的反應(yīng)體系中合成細(xì)胞總cDNA；PCR體系為50μl，內(nèi)含模板2μl，Taq酶5U（TAKA－RA，Japan），目的引物各1μl，補(bǔ)足為50μl。反應(yīng)條件除退火溫度外均為預(yù)變性94℃4min，變性94℃30s，退火30s，延伸72℃30s，25個(gè)循環(huán)數(shù)。退火溫度依次為survivin為59.5℃，β－actin為57.5℃。

4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 人宮頸癌組織活檢或者手術(shù)切除離體半小時(shí)內(nèi)，含1000U/ml的青霉素（Gibco，USA）和1000μg/ml鏈霉素（Gibco，USA）PBS沖洗以去除污染的紅細(xì)胞；將其剪成小碎片，0.5mg/ml膠原酶IV＋DMEM/F12（Gibco）、37℃中消化過(guò)夜，1500g離心，棄 上 清，0.025mmol/L EDTA－胰 酶 （Gibco，USA）37℃消化半小時(shí)，用去離子水按1∶4稀釋結(jié)合緩沖液（20ml結(jié)合緩沖液＋60ml去離子水）。用250μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，使其濃度為1×105/ml。加100μl的細(xì)胞懸液入5ml流式管中，每管加入5μl Annexin V/FITC和5μl 20μg/ml的 PI，避光混勻，標(biāo)記15min。對(duì)照不加Annexin V作校正因子。在反應(yīng)管中加入400μl PBS。用流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)，光源為488nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)均采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞凋亡和增殖指數(shù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

化療3個(gè)療程后，絕大多數(shù)患者腫塊明顯縮?。?3/60，88.3%）。RT－PCR 檢測(cè)survivin表達(dá)，化療后survivin表達(dá)明顯下降，即使腫瘤縮小不明顯的患者，其survivin表達(dá)亦明顯下降；細(xì)胞凋亡明顯增加。見(jiàn)附表。

附表化療前后survivin的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞凋亡率

討 論

宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌居第2位，在發(fā)展中國(guó)家婦女中其發(fā)病率居第一位［1－2］。因?yàn)閷m頸癌病人的年輕化，傳統(tǒng)的手術(shù)后病人無(wú)法生育，而放療又對(duì)卵巢功能有很大的影響［3］，使人們意識(shí)到了宮頸癌給予化療的可能性。早在1982年Frei提出腫瘤手術(shù)前早期輔助化療的概念以來(lái)［4］，宮頸癌化療的方案也越來(lái)越多，化療以后的效果，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視［4］。

多西他賽是半合成的紫杉類抗腫瘤藥，抗瘤譜較紫杉醇廣，可以與游離微管蛋白結(jié)合，促進(jìn)微管蛋白組裝成穩(wěn)定的微管，其作用是紫杉醇的2倍，并抑制其解聚，從而抑制細(xì)胞有絲分裂，另外多西他賽還是一種有效的Bcl－2磷酸化誘導(dǎo)劑，可以誘導(dǎo)Bcl－2蛋白過(guò)度表達(dá)的實(shí)體瘤細(xì)胞凋亡。常見(jiàn)的主要?jiǎng)┝肯拗菩远拘詾檫t發(fā)性腹瀉和中性粒細(xì)胞減少，其它的毒性反應(yīng)為膽堿能綜合征，惡心、嘔吐、乏力、脫發(fā)。卡鉑為鉑的金屬絡(luò)合物，作用似烷化劑，主要作用靶點(diǎn)為DNA，作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，形成DDP－DNA復(fù)合物，干擾DNA復(fù)制，或與核蛋白及胞漿蛋白結(jié)合。屬周期非特異性藥，主要副作用為消化道反應(yīng)、腎毒性、骨髓抑制［5］。

生存素（surviving）是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤特異性凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族新成員，具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙功能蛋白，同時(shí)參與血管形成的作用［6］。survivin可抑制多種凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凋亡抑制因子［7］。survivin和其他IAP蛋白的分布和表達(dá)模式不同，其他IAP蛋白在生理情況下廣泛分布于成人各種組織中，不同之處僅為表達(dá)水平的不同；survivin僅表達(dá)于胚胎和胎兒發(fā)育過(guò)程中，并且隨著胚胎組織的發(fā)育成熟，survivin的分布逐步局限，表達(dá)水平逐漸降低直至不表達(dá)。在正常成人，除了在胎盤、胸腺、增生期和分泌期的子宮內(nèi)膜中有較弱的表達(dá)外，其余正常分化成熟組織均未發(fā)現(xiàn)。survivin在幾乎所有的癌組織中均有表達(dá)。文獻(xiàn)報(bào)道的宮頸癌的survivin的表達(dá)35%～90%，survivin蛋白的表達(dá)率和表達(dá)量與腫瘤不良預(yù)后、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤周圍浸潤(rùn)成正相關(guān)［8］?，F(xiàn)有研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是細(xì)胞增殖失控、分化異常的結(jié)果，而且與細(xì)胞凋亡失衡有關(guān)。多種因素綜合作用，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖和（或）凋亡抑制，進(jìn)而造成細(xì)胞無(wú)限生長(zhǎng)，從而形成腫瘤。survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)、特殊的組織分布和作用機(jī)制及明顯的抗凋亡作用尤為引人注目；survivin與細(xì)胞凋亡指數(shù)成負(fù)相關(guān)［9］。

新輔助術(shù)前化療（NACT）的目的一是希望化療后局部腫瘤縮小，從而可減少切除范圍，降低手術(shù)造成的損傷；其次是化療可清除或抑制可能存在的微轉(zhuǎn)移灶，從而改善預(yù)后。但是NACT的確切機(jī)制尚不清楚，我們推測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因相互作用的結(jié)果。新輔助化療的分子機(jī)制已經(jīng)有了一系列的研究，發(fā)現(xiàn)其可以下調(diào)部分腫瘤基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究表明卡鉑聯(lián)合多西他賽可有效抑制survivin表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，從另外一個(gè)角度對(duì)宮頸癌的輔助化療機(jī)制進(jìn)行了探討，而且奈達(dá)鉑聯(lián)合伊立替康在宮頸癌化療中的良好效果，亦說(shuō)明這種化療方案值得在臨床上進(jìn)一步推廣，而這種方案引起宮頸癌中survivin的表達(dá)下調(diào)亦說(shuō)明了其的一部分作用機(jī)理。

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