miR－3960真核表達載體的構(gòu)建及其對成骨細(xì)胞礦化的影響＊

陜西省人民醫(yī)院（西安710068） 李 輝 郭 劍 張 艷 龐雅玲 李曉燕 吳貴福

miRNAs是一類小的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，能夠與靶mRNA的特定序列結(jié)合，通過降解靶mRNA或抑制翻譯發(fā)揮其重要的調(diào)控作用。目前研究已發(fā)現(xiàn)miRNAs在細(xì)胞分化與凋亡、生長發(fā)育、糖脂代謝、炎癥、免疫應(yīng)答以及腫瘤發(fā)生等多個生理和病理過程中均扮演著關(guān)鍵的角色［1－2］，其在成骨細(xì)胞分化調(diào)控過程中的作用也已被多個實驗證實。miR－3960是最近發(fā)現(xiàn)的一個新的在成骨細(xì)胞表達的miRNA，其表達水平隨成骨細(xì)胞的分化進程而逐步增加，提示其可能在成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮一定作用。為明確miR－3960對成骨細(xì)胞礦化的影響，本研究將miR－3960的前體序列克隆入真核表達載體pSilencer 4.1－CMV puro中，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞，觀察miR－3960對成骨細(xì)胞礦化的影響，為深入研究miR－3960在成骨細(xì)胞分化中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材 料 pSilencer 4.1－CMV puro載體購自美國Ambion公司。rTaq DNA聚合酶、T4DNA連接酶購于大連寶生物公司。BamH I、Hind III內(nèi)切酶購自美國NEB公司。DNA膠回收試劑盒購自美國QIAGEN公司。小鼠基質(zhì)細(xì)胞ST2購買自日本RIKEN生物資源中心；α－MEM培養(yǎng)基及胎牛血清（FBS）購自美國GIBICO公司。人重組BMP－2蛋白購于美國Peprotech公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方 法 ①miR－3960表達載體的構(gòu)建：根據(jù)miR－3960的前體序列設(shè)計引物，兩條引物的5′分別含有BamH I和Hind III酶切位點，引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成并純化。P1：5’－GATCCGGCCACGGCTTCCTGCGCCCCCGATCGGGGCCGCCAACA GCGCTGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGGGGCAGT GGCGGAAA－3’；P2：5’－AGCTTTTCCGCCACTGCCCCCGCCTCCGCCGCCGCCGCCAGCGCTGTT GGCGGCCCCGATCGGGGGCGCAGGAAGCCGT GGCCG－3’。將合成的兩條寡核苷酸用去離子水稀釋成100μmol/L，各取2μl，與46μl退火緩沖液混合，95℃4min，70℃10min，30℃30min，緩慢降溫至4℃得到退火雙鏈DNA。隨后對pSilencer 4.1－CMV puro進行線性化：用BamH I和Hind III對質(zhì)粒進行雙酶切，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒10μl，10緩沖液4μl，BamH I 2μl，Hind III 2μl，去離子水22μl，37℃酶切3h，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖膠電泳，用DNA膠回收試劑盒回收線性載體片段。將線性化質(zhì)粒與退火后的產(chǎn)物于16℃連接過夜。制備感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性LB平板上篩選重組載體。擴增白色的抗性菌落，提取質(zhì)粒并以BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定重組質(zhì)粒。把酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送南京金思特公司使用pSilencer 4.1－CMV puro通用引物進行測序，質(zhì)粒命名為pSilencer4.1－miR－3960。②小鼠基質(zhì)細(xì)胞ST2培養(yǎng)：細(xì)胞在含有10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的α－MEM中培養(yǎng)。細(xì)胞置于37℃、飽和濕度及5%CO2條件下培養(yǎng)。每周換液2次，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。當(dāng)誘導(dǎo)ST2向成骨細(xì)胞分化時在培養(yǎng)基中加入300ng/ml BMP－2。③pSilencer4.1－miR－3960穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ST2細(xì)胞：ST2細(xì)胞或BMSCs以3×104細(xì)胞/孔的密度接種24孔板，加入不含抗生素的α－MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞匯合達到70%左右時進行轉(zhuǎn)染。取pSilencer4.1－miR－3960 0.8μg，Lipofectamine 2000 2μl用50μlα－MEM 稀釋，輕柔混勻，室溫孵育5min；將以上兩液體輕輕混勻，室溫靜置20min，使脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒；輕柔混勻轉(zhuǎn)染液體，慢慢滴入培養(yǎng)板中，輕微晃動培養(yǎng)板后放入37℃5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48h后加入嘌呤霉素（1μg/ml）進行篩選，待大部分細(xì)胞死亡，并有陽性克隆長出時，在顯微鏡下選定抗性克隆并予以標(biāo)記，用無菌槍頭刮吸克隆生長的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入25ml培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒（miR－C）為對照組。④Northern雜交：將RNA樣品加入等體積的凝膠上樣緩沖液，65℃熱變性10min后立即于冰上放置1min，加入15%的尿素變性聚丙烯酰胺凝膠的上樣孔中，180V電壓電泳至溴酚藍指示帶到達凝膠底部，取下凝膠，在含1μg/ml EB的0.5×TBE中浸泡5min，漂洗3～5min，用紫外凝膠成相系統(tǒng)檢測RNA的完整性及電泳情況。隨后使用半干電轉(zhuǎn)移裝置，400mA恒流轉(zhuǎn)1h，取出尼龍膜在0.5×TBE溶液中漂洗數(shù)秒，置于濾紙上晾干，紫外線交聯(lián)125mJ。將膜置于雜交管中，加入10ml完全溶解的Hyb雜交液，于37℃預(yù)雜交1h，然后換用10ml已加入溶解的探針并充分混勻的Hyb雜交液，于37℃雜交過夜；用2×SSC，0.1%SDS溶液在室溫漂洗2次，再用0.5×SSC，0.1%SDS于室溫洗膜1次。壓片，－70℃X光曝光24～48h，顯影、定影。選用U6為內(nèi)參照，同一張膜經(jīng)洗脫后，加U6探針按上述步驟雜交顯影。⑤鈣沉積量測定：ST2細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，用α－MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)于24孔板，其中含10%FBS、青霉素50U/ml、慶大霉素50μg/ml、BMP－2 300ng/ml、抗壞血酸50mg/ml以及10mMβ－甘油磷酸鈉，培養(yǎng)5d后進行鈣沉積量測定。用不含Ca2＋、Mg2＋的PBS洗細(xì)胞3次，每孔細(xì)胞加入500μl 0.6NHCl，4℃慢搖過夜，第2天收集每孔液體，1000g離心5min，取上清與1ml o－cresolphthalein－complex混勻后用分光光度計在575nm波長下測量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 各實驗獨立重復(fù)3次，重復(fù)性好，所選圖表為重復(fù)實驗的結(jié)果之一。所有統(tǒng)計分析均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較用方差分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1 miR－3960表達載體鑒定 按miR－3960前體設(shè)計引物，將合成的兩條寡核苷酸引物退火，形成雙鏈后連接pSilencer 4.1－CMV puro載體，轉(zhuǎn)化DH5α細(xì)菌，抽提質(zhì)粒，采用HindIII及BamHI雙酶切鑒定，由圖1可見酶切釋放大小分別為4.8kb和73bp的兩個片段，與預(yù)期相符。隨后質(zhì)粒送交南京金思瑞公司測序證實序列正確（圖2），證明載體構(gòu)建成功。

圖1 pSilencer4.1－miR－3960表達載體酶切圖

圖2 miR－3960連接pSilencer 4.1－CMV puro經(jīng)酶切后測序圖譜

2 Northern印記雜交檢測miR－3960表達 圖3顯示在分別轉(zhuǎn)染miR－3960表達載體及miR－C 48h后，兩組BMP－2誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞中 miR－3960的表達差異。Northern印記雜交的結(jié)果顯示，pSilencer4.1－miR－3960組中miR－3960有較強的表達，而對照組中則未檢測到miR－3960表達。表明miR－3960表達載體的轉(zhuǎn)染成功實現(xiàn)miR－3960在BMP－2誘導(dǎo)的ST2細(xì)胞中的過表達。

圖3 轉(zhuǎn)染miR－3960表達載體或miR－C的BMP－2誘導(dǎo)ST2細(xì)胞中miR－3960的表達

3 miR－3960對成骨細(xì)胞礦化的影響 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pre－miR－3960后用BMP－2持續(xù)誘導(dǎo)ST2向成骨細(xì)胞分化5d，用鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法檢測細(xì)胞中鈣沉積量。如圖4所示，miR－3960過表達的細(xì)胞在同樣誘導(dǎo)條件下對鈣沉積量的增加作用較對照組顯著。

圖4 miR－3960過表達對ST2細(xì)胞鈣沉積量的影響

討 論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)多個miRNA參與調(diào)控成骨細(xì)胞的分化，如miR－26a能作用于SMAD1發(fā)揮對成骨分化的抑制作用［3］。miR－133和 miR－135分別作用于Runx2和SMAD5，抑制二者表達，進而抑制成骨細(xì)胞的分化［4］。而 Mizuno等［5］發(fā) 現(xiàn) miR－210 能 夠 促 進ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，其機制是miR－210抑制AcvR1b，從而抑制TGF－beta/activin信號通路。我們之前的研究也證實一個在成骨細(xì)胞高表達的miRNA——miR－2861可以通過抑制HDAC5的表達來發(fā)揮其促進成骨細(xì)胞分化的作用［6］。本研究選取另一個在成骨細(xì)胞高表達的miRNA——miR－3960作為研究對象，成功構(gòu)建miR－3960的表達載體，并將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染于ST2細(xì)胞，明確其可以促進成骨細(xì)胞的礦化。

miRNA的產(chǎn)生過程是一個由多個酶介導(dǎo)的多步驟的過程［7］。首先在體內(nèi)生成長度在100～1000nt的初級轉(zhuǎn)錄物（pri－miRNA），隨后被剪切成長度約在65～100nt并具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體（pre－miRNA），再由ATP依賴的核酸內(nèi)切酶Dicer將其剪切成19～26nt長的miRNA。只有成熟的miRNA才能通過與靶mRNA的特定序列結(jié)合，進而負(fù)性調(diào)控靶基因表達。

根據(jù)miRNA生成過程的這一特點，要達到在細(xì)胞中達到過表達miRNA的目的，通常需要擴增miRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)及一些側(cè)翼序列，并直接克隆PCR產(chǎn)物，將該產(chǎn)物連接到質(zhì)?；虿《据d體，然后將其轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞，由細(xì)胞內(nèi)Dicer作用后生成成熟的miRNA，這符合miRNA的一般生物合成過程和作用原理，效果穩(wěn)定。本研究選取pSilencer 4.1－CMV作為連接載體，該載體上攜帶有RNA聚合酶II啟動子，其連接發(fā)夾結(jié)構(gòu)的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞來獲得siRNA表達已被廣泛應(yīng)用。miR－3960的前體pre－miR－3960長度為73 bp，根據(jù)miRbase數(shù)據(jù)庫中提供pre－miR－3960序列，我們設(shè)計了一對引物，并在引物的5’端分別加了BamH I和HindⅢ酶切位點，退火后得到含酶切位點的pre－miR－3960，隨后用BamH I和HindⅢ進行酶切后，將其克隆至pSilencerm4.1－CMV puro載體中構(gòu)成miRNA－3960的表達質(zhì)粒。將該質(zhì)粒送交公司經(jīng)測序證實序列完全正確。隨后將該表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染于ST2細(xì)胞后，檢測到miR－3960表達水平顯著增加，進一步證實載體構(gòu)建成功。這說明pSilencer 4.1－CMV用來構(gòu)建miRNA表達載體是有效可行的。Lee等［8］用pSilencer 4.1－CMV構(gòu)建的 miR－15a表達載體轉(zhuǎn)染PCK－CCL細(xì)胞后同樣能夠使miR－15a在細(xì)胞內(nèi)高表達。為明確miR－3960對成骨細(xì)胞礦化的影響，本研究選取鈣沉積量作為觀察指標(biāo)。在ST2細(xì)胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR－3960表達載體，并加用BMP－2誘導(dǎo)ST2細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，結(jié)果表明miR－3960過表達組鈣沉積量明顯增加，提示miR－3960可以促進成骨細(xì)胞礦化。

綜上，本實驗成功構(gòu)建了miR－3960的表達載體，且實驗證明其可以促進成功細(xì)胞的礦化，為進一步研究miR－3960在成骨細(xì)胞分化中的作用提供了較好的實驗基礎(chǔ)。由于miRNA發(fā)揮調(diào)控作用是通過與靶mRNA的特定序列結(jié)合來實現(xiàn)的，因此下一步我們將研究其可能作用的靶基因，深入探討miR－3960在成骨細(xì)胞分化中的作用機制

［1］ Friedman JM，Jones PA.MicroRNAs：critical mediators of differentiation.development and disease［J］.Swiss Med Wkly，2009，139（33－34）：466－472.

［2］ Lundstrom K.MicroRNA in disease and gene therapy［J］.Curr Drug Discov Technol，2011，8（2）：76－86.

［3］ Luzi E，Marini F，Sala SC，et al.Osteogenic differentiation of human adipose tissue－derived stem cells is modulated by the miR－26atargeting of the SMAD1transcription factor［J］.J Bone Miner Res，2008，23（2）：287－295.

［4］ Li Z，Hassan MQ，Volinia S，et al.A microRNA signature for a BMP2－induced osteoblast lineage commitment program［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（37）：13906－13911.

［5］ Mizuno Y，Tokuzawa Y，Ninomiya Y，et al.miR－210promotes osteoblastic differentiation through inhibition of AcvR1b［J］.FEBS Lett，2009，583（13）：2263－2268.

［6］ Li H，Xie H，Liu W，et al.A novel microRNA targeting HDAC5regulates osteoblast differentiation in mice and contributes to primary osteoporosis in humans［J］.J Clin Invest，2009，119（12）：3666－3677.

［7］ Gregory RI，Yan KP，Amuthan G，et al.The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs［J］.Nature，2004，432（7014）：235－240.

［8］ Lee SO，Masyuk T，Splinter P，et al.MicroRNA15amodulates expression of the cell－cycle regulator Cdc25Aand affects hepatic cystogenesis in a rat model of polycystic kidney disease［J］.J Clin Invest，2008，118（11）：3714－3724.