軟肝顆粒的工藝設(shè)計(jì)

廣東省深圳市中醫(yī)院 張尚斌 廖偉明 曾鵬宇 （深圳 518033）

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器 紫外光燈 （ZF－2型，上海市安亭電子儀器廠）、超聲儀 （HKD1002VS，深圳市和達(dá)設(shè)備有限公司）、高效液相色譜儀 （SPA－M20A，日本島津）、紫外分光光度計(jì) （UV－1800，SHIMADZU）。

1.2 材料 丹參酮ⅡA對(duì)照品 （110766－200416，中國(guó)藥品生物制品檢定所）;三七對(duì)照品 （120941－200506，中國(guó)藥品生物制品檢定所）;三七對(duì)照藥材 （康美藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):091205971）;陰性對(duì)照品 （缺三七）;樣品1（深圳中醫(yī)院制品:批號(hào)090618）;樣品2（深圳中醫(yī)院制品:批號(hào)090910）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝的研究 將處方中五味子、丹參用乙醇滲漉，滲漉液、藥渣備用;余藥加入五味子、丹參藥渣，加水煎煮2次，合并煎液，濾過(guò)后濃縮，放冷靜置。取上清液，加入五味子、丹參滲漉液，濃縮成稠膏后制成顆粒。

2.2 定性鑒別

2.2.1 三七:取樣品和陰性對(duì)照品 （缺三七）各10 g，粉碎，加甲醇40 mL超聲處理1 h，過(guò)濾，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，用水飽和正丁醇萃取3次，每次20 mL，正丁醇液用氨試液洗3次，每次20 mL，再用正丁醇飽和的水洗3次，每次20 mL，蒸干，加甲醇1 mL作為供試品溶液。精密稱(chēng)取丹參酮ⅡA對(duì)照品10 mg，置50 m L棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。吸取上述4種溶液各12 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙脂－甲醇－水 （15︰40︰2︰10）10℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，涼干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2.2 丹參酮ⅡA:取本品10 g，加無(wú)水乙醚20mL超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液揮干，殘?jiān)哟姿嵋阴?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參酮IIA對(duì)照品，加醋酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶15μL，供試品溶10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以甲醇－－醋酸乙酯 （19︰1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置日光下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上，分別顯相同的橙紅色斑點(diǎn)。［1］

2.3 丹參酮ⅡA有效成分的含量測(cè)定［2］

2.3.1 色譜條件:色譜柱:十八烷基合硅膠為填充劑。流動(dòng)相:甲醇－水。檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm。柱溫:室溫。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取丹參酮ⅡA對(duì)照品10 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得 （每1 mL中含丹參酮ⅡA 16μg）。

2.3.3 供試品溶液的配置:取本品若干，粉碎后精密稱(chēng)取3.00 g，精密加入甲醇30.00 mL，塞緊，稱(chēng)定重量，超聲20 min后加熱回流0.5 h，冷卻至室溫后稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)足減失量，搖勻，用微孔濾過(guò)膜 （0.45μm）濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.4 樣品測(cè)定:精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，用外標(biāo)法測(cè)定。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)與結(jié)果 通過(guò)對(duì)軟肝顆粒的制備過(guò)程的考察，影響軟肝顆粒療效的因素有:加水量、提取時(shí)間、滲漉醇濃度、提取溫度等，現(xiàn)對(duì)滲漉乙醇濃度、加水量、提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)研究，以確定相關(guān)因素及其范圍，結(jié)果如下。

2.4.1 滲漉醇濃度影響:在加水量為8倍，提取時(shí)間為2 h條件下研究40%、65%、75%、85%、95%不同乙醇濃度對(duì)丹參酮ⅡA含量的影響，結(jié)果分別是0.438、0.577、0.612、0.630、0.623mg/g。由此可以看出，隨著乙醇濃度的增加，丹參酮ⅡA的含量也在增加，在85%時(shí)到達(dá)最高值，之后丹參酮ⅡA輕微減弱。在85%的濃度前后，丹參酮ⅡA含量為最大而且變化不大。因此，選擇75%、85%和95%這3個(gè)效果較好的乙醇濃度作進(jìn)一步的正交實(shí)驗(yàn)。

2.4.2 加水量的影響:在滲漉醇濃度為85%，提取時(shí)間2 h條件下研究加水量為6、8、10、12、14倍，5個(gè)倍數(shù)對(duì)丹參酮ⅡA含量的影響，結(jié)果分別是0.335%、0.537%、0.593%、0.575%、0.523% 。由此可以看出，當(dāng)加水量從6倍增加到10倍，丹參酮ⅡA含量上升;隨著加水量的繼續(xù)增加，丹參酮ⅡA含量又呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)樵谥兴幖逯筇崛∵^(guò)程中，在一定條件下，存在最佳加水量。當(dāng)加水量過(guò)低時(shí)，溶劑不足以把物料中的物質(zhì)提取出來(lái);當(dāng)加水量過(guò)多時(shí)，過(guò)多的水會(huì)起到稀釋作用，從而影響丹參酮ⅡA含量。由此可知在10倍加水量前后，丹參酮ⅡA含量為最大而且變化不大。因此，選擇8倍、10倍和12倍這3個(gè)效果較好的加水量做進(jìn)一步的正交實(shí)驗(yàn)。

2.4.3 提取時(shí)間影響:在滲漉醇濃度為85%，加水量為10倍條件下，研究提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，不同時(shí)間對(duì)丹參酮ⅡA含量的影響，結(jié)果分別是0.423、0.508、0.552、0.571、0.576 mg/g。 由此可見(jiàn)，隨著提取時(shí)間的增加，丹參酮ⅡA含量也在增加。而丹參酮ⅡA含量在0.5～1.5 h的時(shí)間內(nèi)，增加速度較快;在2 h之后，丹參酮ⅡA含量隨著時(shí)間的變化不大。故選擇1.5、2.0、2.5 h這3個(gè)效果較好的提取時(shí)間做進(jìn)一步的正交實(shí)驗(yàn)。

2.5 正交試驗(yàn)與結(jié)果 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)影響提取的主要因素為加水量 （A），提取時(shí)間 （B），還有滲漉醇的濃度（C）等3個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以丹參酮ⅡA的有效成分為指標(biāo)，優(yōu)選最佳提取工藝。正交設(shè)計(jì)各因素水平情況見(jiàn)表1。

表1 軟肝顆粒因素水平表

表2 正交試驗(yàn)的試驗(yàn)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)構(gòu)

結(jié)果:從表2，表3直觀分析和方差分析一起考察可見(jiàn)，滲漉醇濃度有顯著影響，其他兩個(gè)影響不明顯不顯著。所以，最后確定的最優(yōu)工藝為A2B2C2，即滲漉醇濃度為85%，提取時(shí)間為2 h，加水量為10倍為最佳工藝條件。

2.6 優(yōu)選提取工藝條件重復(fù)性試驗(yàn) 為進(jìn)一步考察上述優(yōu)選工藝的穩(wěn)定性，以工藝重復(fù)試驗(yàn)3次，即選用滲漉醇濃度為85%，提取時(shí)間為2 h，加水量為10倍，進(jìn)行重復(fù)3次提取。結(jié)果試驗(yàn)號(hào)1、2、3的丹參酮ⅡA含量分別是0.672、0.683、0.669 mg/g，平均值為0.675 mg/g。表明:工藝A2B2C2，丹參酮ⅡA含量0.675±0.008，工藝穩(wěn)定。且丹參酮ⅡA含量較高，證明工藝合理。

2.7 討論與注意問(wèn)題

2.7.1 波長(zhǎng)的選擇:對(duì)丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液在波長(zhǎng)200～400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測(cè)顯示，其波長(zhǎng)270 nm處有最大吸收，與1995版藥典采用的波長(zhǎng)相同。

2.7.2 由于丹參酮ⅡA在操作過(guò)程中容易揮發(fā)，且遇光、遇熱都不穩(wěn)定，很容易造成丹參酮ⅡA含量不穩(wěn)定，所以丹參酮ⅡA操作時(shí)間不宜太長(zhǎng)，溫度不宜太高，達(dá)到甲醇的沸點(diǎn) （64.5℃）即可。

2.7.3 工藝條件篩選部分使用了正交試驗(yàn)法并通過(guò)方差方法進(jìn)行分析，雖然不能像全面試驗(yàn)?zāi)菢訉?duì)各因素效應(yīng)、交互作用一一分析;當(dāng)交互作用存在時(shí)，有可能出現(xiàn)交互作用的混雜。但它能通過(guò)部分試驗(yàn)找到最優(yōu)水平組合。特點(diǎn)如下:完成試驗(yàn)要求所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù)少，數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布很均勻，可用相應(yīng)的極差分析方法、方差分析方法、回歸分析方法等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，引出許多有價(jià)值的結(jié)論。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際情況得出提取的最佳工藝方案為:滲漉醇濃度為85%，提取時(shí)間為2.0 h，加水量為10倍。又經(jīng)過(guò)驗(yàn)證性試驗(yàn)表明本試驗(yàn)優(yōu)選的最佳制備工藝合理、穩(wěn)定、可行。

［1］ 劉桂珍，劉紀(jì)青，廖朝峰，等.完善滋腎降糖丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2011，26（1）:33－34

［2］ Nobuyuki Okamura，et al.high－performance liquid chromatography of abietane－ type compounds［J］ .J Chromatogr，1991，542:317

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì)編.中國(guó)藥典 ［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1995.98

（2011－12－16 收稿）