IL-18BP聯(lián)合潑尼松治療阿霉素腎病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

王麗敏,亞瑟爾

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科,黑龍江佳木斯 154003)

患有腎病綜合征的兒童會(huì)有腎小球毛細(xì)血管壁滲透性增加的癥狀,這將導(dǎo)致大量蛋白尿和低蛋白血癥。腎病綜合征主要是兒科疾病,兒童患病率比成年人多 15倍[1]。雖然任何年齡都有感染的機(jī)會(huì),但是兒童時(shí)期感染最常見(jiàn)。這一般與個(gè)體和(或)家族過(guò)敏史有關(guān)[2]。腎病綜合征的特點(diǎn)是大量的蛋白尿(成人＞ 3.5g/24h或兒童 40mg/m2˙h,低白蛋白血癥 (＜2.5g/L),水腫和高脂血癥[1]。高脂血癥是由于機(jī)體代償性合成蛋白增加導(dǎo)致的結(jié)果[3]。微小病變型腎病(MCNS)在患有原發(fā)性腎病綜合征兒童中是最常見(jiàn)的病理類型[4]。最近,遺傳篩選方法支持了 T細(xì)胞起到關(guān)鍵作用的說(shuō)法[5]。在腎病癥候群中已有眾多 T淋巴細(xì)胞因子起源的改變。這些細(xì)胞因子的表達(dá)異常,包括腫瘤壞死因子(TNF-α),血管滲透性生長(zhǎng)因子(V PGF),以及 IL-1,IL-2,IL-4,IL-8,IL-10,IL-12,IL-13和 IL-18[6]。IL-18BP是 IL-18內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑,它可以通過(guò) IL-18的受體結(jié)合來(lái)有效的抑制生物活性 。它能夠抑制由 IL-18引發(fā)的 IFN-γ和 IL-8的產(chǎn)生以及 N FKB的體外生產(chǎn)和 LPS誘導(dǎo)的 IFN-γ在體內(nèi)的生產(chǎn)。因此,我們用阿霉素培養(yǎng)的微小病型腎病鼠模型來(lái)觀察探討 IL-18BP和潑尼松聯(lián)合治療對(duì)阿霉素腎病大鼠蛋白尿的影響及 IL-18BP可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

6周齡 56只健康、雄性 Wistar大鼠,體重(100±20)g,兩次尿蛋白定性是陰性,由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 研究方法

1.2.1 分組及模型的制備:56只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)選擇正常組10只,腎病組46只。注射阿霉素(海正藥業(yè)有限責(zé)任公司,10毫克 /小瓶)根據(jù)王崢等人[7]方法,一次性尾靜脈注射阿霉素為5mg/kg制備阿霉素腎病大鼠,正常對(duì)照組注射等量生理鹽水,第 6天,收集所有大鼠尿測(cè)24h尿蛋白量。尿蛋白＞30mg/24h被視為成功,去除不符合標(biāo)準(zhǔn)4只。其余腎病大鼠 (42只),隨機(jī)分為4組,腎病模型組 (n=12),強(qiáng)的松治療組(n=10),IL-18治療組(n=10),強(qiáng)的松和 IL- 18聯(lián)合治療組(n=10)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法:(1)24h尿蛋白檢測(cè):用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)24h尿蛋白定量。(2)血生化檢測(cè):用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、白蛋白 (Alb)、尿素氮 (BUN)、肌酐 (Scr)。(3)用 ELISAKit檢測(cè)血清 IL-18、IFN-γ和 IL-4水平。(4)給藥方法:造模成功后潑尼松組第1～ 7天每天給藥 13.5mL/kg(6.3mg/kg)第 8～15天,每天減量 10%,第 16～ 28天每天給藥 2.7mL/kg(1.25mg/kg);聯(lián)合組給予同劑量潑尼松,1h后再加用白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白(中美生物技術(shù)有限公司,北京)0.2mL腹腔注射;白介素18結(jié)合蛋白組給予白細(xì)胞介素18結(jié)合蛋白0.2mL腹腔注射。各組于每天上午 8時(shí)開(kāi)始第1次給藥,連續(xù)28d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS版本17.0軟件進(jìn)行分析和處理數(shù)據(jù),測(cè)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,兩組間均值比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿蛋白變化

模型組及治療組24h尿蛋白定量較正常組明顯升高,呈現(xiàn)大量蛋白尿 (P＜0.01),但聯(lián)合治療組與潑尼松組、IL-18BP組相比,尿蛋白明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.01)。見(jiàn)表 1。

表1 各組大鼠24h尿蛋白水平(±s,mg/24h,n=10)

表1 各組大鼠24h尿蛋白水平(±s,mg/24h,n=10)

與正常組比較★P＜0.01;與模型組比較◆P＜0.01;與潑尼松組、IL-18BP組比較☆P＜0.01。

組別 7d 14d 28d 42d正常組 6.00± 0.8 5.98±0.78 6.08± 0.70 5.96± 0.74模型組 52.4± 4.30★ 130.20±6.72★ 251.10± 11.44★ 288.15± 14.60★潑尼松組 46.60± 8.12★◆ 66.24±27.31★◆ 134.18± 64.30★◆ 88.44± 28.74★◆IL-18BP組 51.6± 1.89★◆ 116.88±9.38★◆ 207.74± 9.12★◆ 132.82± 8.22★◆聯(lián)合治療組 44.8± 6.14★◆ 62.24±20.32★◆☆ 122.14± 44.6★◆☆ 52.48± 21.26★◆☆

2.2 血生化指標(biāo)

模型組血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)顯著高于正常對(duì)照組、治療組 (P＜0.01);白蛋白(ALB)顯著低于正常組 (P＜0.01);而聯(lián)合治療組與潑尼松組、IL-18BP組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量各組間無(wú)顯著性差異 (P＞ 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清 TC,TG,Alb,BUN,SCr水平 (±s,n=10)

表2 各組大鼠血清 TC,TG,Alb,BUN,SCr水平 (±s,n=10)

與正常組比較★P ＜0.01;與模型組比較◆P＜0.01;與潑尼松組、IL-18BP組比較☆P＜0.01;BUN和 SCr水平在5組中無(wú)明顯差異(P＞ 0.05)。

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) Alb(g/L) BUN(mmol/L) SCr(μ mol/L)正常組 0.84± 0.19 0.68± 0.08 32.44± 2.56 6.33± 0.01 17.04± 0.88模型組 3.40± 0.74★ 2.20± 0.04★ 20.15± 1.69★ 7.81± 0.14★ 18.77± 1.26★潑尼松組 1.88± 0.32★◆ 2.84± 1.42★◆ 28.86± 3.36★◆ 5.98± 0.42★◆ 16.82± 0.74★◆IL-18BP組 2.16± 0.48★◆ 1.83± 0.24★◆ 27.36± 1.76★◆ 7.74± 0.16★◆ 17.34± 0.62★◆聯(lián)合治療組 1.52± 0.60★◆☆ 2.68± 0.82★◆☆ 29.34± 2.64★◆☆ 6.44± 0.36★◆☆ 17.24± 0.86★◆☆

2.3 血清 IL-4水平的表達(dá)

模型組各期血清 IL-4水平均有所下降,低于正常對(duì)照組、治療組 (P＜0.01)。而聯(lián)合治療組與潑尼松組、IL-18BP組相比升高明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清 IL-4水平 (±s,pg/mL,n=10)

表3 各組大鼠血清 IL-4水平 (±s,pg/mL,n=10)

與正常組比較★P＜0.01;與模型組比較◆P＜0.01;與模型組比較▲P＞ 0.05;與潑尼松組、IL-18BP組比較☆P＜0.01。

時(shí)間 /分組 正常組 模型組 潑尼松組 IL-18BP組 聯(lián)合治療組7d 15.22± 1.44 63.68±3.27★ 68.24± 3.88★◆▲ 68.39± 4.88★◆▲ 70.39± 4.34★◆▲☆14d 14.26± 0.88 62.81±4.31★ 88.42± 4.86★◆ 108.42± 3.54★◆ 114.42± 3.42★◆☆28d 15.49± 1.38 56.18±1.73★ 96.49± 3.42★◆ 112.49± 3.42★◆ 119.49± 4.64★◆☆42d 14.77± 1.32 53.11± 3.61★ 96.86.20± 4.34★◆ 120.20± 4.19★◆ 132.20± 6.13★◆☆

2.4 血清 IL-18、IFN-γ水平的表達(dá)

模型組各期血清 IL-18、IFN-γ水平均高于正常對(duì)照組、治療組 (P＜0.01)。而聯(lián)合治療組與潑尼松組、IL-18BP組相比下降明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);見(jiàn)表4,5。

表4 各組大鼠血清 IL-18水平(±s,pg/mL,n=10)

表4 各組大鼠血清 IL-18水平(±s,pg/mL,n=10)

與正常組比較★P＜0.01;與模型組比較◆P＜0.01;與模型組比較▲P＞ 0.05;與潑尼松組、IL-18BP組比較☆P＜0.01。

時(shí)間 /分組 正常組 模型組 潑尼松組 IL-18BP組 聯(lián)合治療組7d 260.46± 7.98 390.44± 12.80★ 384.12± 14.16★◆▲ 380.04±26.87★◆▲ 374.22± 24.40★◆▲☆14d 254.7± 11.68 540.84± 38.20★ 522.74±30.18★◆ 482.04± 20.12★◆ 466.48± 24.64★◆☆28d 260.88± 8.12 754.38± 44.78★ 720.12±50.14★◆ 647.96± 58.74★◆ 633.38± 56.32★◆☆42d 253.6± 8.80 870.52± 14.76★ 682.96±44.26★◆ 634.12± 48.94★◆ 618.9± 46.26★◆☆

表5 各組大鼠血清 IFN-γ水平 (±s,pg/mL,n=10)

表5 各組大鼠血清 IFN-γ水平 (±s,pg/mL,n=10)

與正常組比較★P＜0.01;與模型組比較◆P＜0.01;與模型組比較▲P＞ 0.05;與潑尼松組、IL-18BP組比較☆P＜0.01。

時(shí)間 /分組 正常組 模型組 潑尼松組 IL-18BP組 聯(lián)合治療組7d 81.45± 3.29 96.45± 3.30★ 96.66± 2.20★◆▲ 98.25±1.33★◆▲ 98.22± 2.10★◆▲☆14d 83.78± 4.35 115.66± 4.99★ 112.96± 3.40★◆▲ 102.84± 2.56★◆ 100.82± 3.2456★◆☆28d 85.66± 4.46 126.18± 15.85★ 120.14± 6.34★◆ 108.04± 3.28★◆ 106.84± 3.30★◆☆42d 85.41± 2.23 131.17±5.33★ 124.45±4.62★◆ 103.38± 4.86★◆ 99.14± 2.04★◆☆

3 討論

微小變化腎病綜合征的顯著的臨床特點(diǎn)之一是蛋白尿,它在腎臟疾病的進(jìn)展中起著重要的作用。長(zhǎng)期的尿蛋白可以引起腎小管損傷,進(jìn)一步引起腎臟損害。兒童 PN S的發(fā)病機(jī)制迄今仍未明確,因此,研究蛋白尿的機(jī)制對(duì)微小病變型腎病綜合征的診斷和治療起著至關(guān)重要的作用。白細(xì)胞介素18(IL-18)是一種新發(fā)現(xiàn)的炎癥因子,并與輔助性 T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性已經(jīng)得到更多的關(guān)注。白細(xì)胞介素18(IL-18)開(kāi)始時(shí)是當(dāng)做干擾素 γ(IFN-γ)的引導(dǎo)因子 (IGIF)被發(fā)現(xiàn)的[8]。此外,在 IL-12的協(xié)同下,IL-18會(huì)生產(chǎn)干擾素γ并且使 T細(xì)胞增殖[9]。與 T細(xì)胞相似,NK細(xì)胞也可以被 IL-18[10]激活從而激增。具體來(lái)說(shuō),IL-18可以介導(dǎo) N K細(xì)胞的細(xì)胞毒作用[11],IL-18介導(dǎo)的免疫反應(yīng)不僅克服病毒,細(xì)菌和真菌感染,而且還可以通過(guò)激活免疫細(xì)胞抵制病原感染。在其他功能上 IL- 18類似于 IL-1,現(xiàn)已被歸類在 IL-1系列中的促炎性細(xì)胞因子。最近的研究還顯示出,在患有微小病變型腎病的患者的血液和尿液里,IL-18的水平不斷上升,這表示 IL-18在微小病型腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn) IL-18和 IFN-γ的異常表達(dá)與蛋白尿的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn),PN S時(shí)存在 Th1/Th2細(xì)胞和 /或 Th1/Th2類細(xì)胞因子分泌失衡。其中 Th1類細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫或遲發(fā)性超敏反應(yīng);Th2類細(xì)胞主要參與體液免疫。IL-18及以 Th1型為主的免疫失衡在 MCNS發(fā)病機(jī)制中起重要作用,這有可能成為 MCNS治療的新途徑[12]。

IL-18BP是一個(gè)具有高親和力特異性結(jié)合和拮抗 IL-18相關(guān)的蛋白因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的微小病變腎病,應(yīng)用 rmIL-18BP治療后,IL-4水平顯著增加,表明rmIL-18BP應(yīng)用能夠抑制輔助性 T細(xì)胞前體的 Th1向 Th2方向轉(zhuǎn)化,促進(jìn) Th1/Th2平衡,抑制或中和內(nèi)源性 IL-18的釋放和活動(dòng),減少各種促炎癥因子在腎臟積累,從而降低蛋白質(zhì)的濾過(guò),減少內(nèi)源性 IL-18導(dǎo)致的微小病變腎病的進(jìn)一步發(fā)展。我們的研究表明各組大鼠尿蛋白、血清 IL-18、IFN-γ明顯高于對(duì)照組 (P＜0.01);而潑尼松與 IL-18BP治療組分別可降低 IFN-γ和 IL-18水平 (P＜0.01),但聯(lián)合治療組降低 IFN-γ和 IL-18水平更明顯,與單一治療組比較差異有顯著性 (P＜0.01),說(shuō)明 IL-18BP與潑尼松聯(lián)合治療組明顯優(yōu)于兩者單一治療組,IL-18和 IFN-γ在腎病進(jìn)展中起重要作用,IL-18BP可能通過(guò)降低 IL-18和 IFN-γ而發(fā)揮治療作用,因此可能成為微小病變腎病治療的新途徑。

[1]Behrman RE,Kliegman R,Jenson HB.Nelson Textbook of Pediatrics[M].18thed p.2190.Philadelphia,PA:WB Saunders Company,2007

[2]Meadow SR,Sarsfield JK.Steroid-responsive nephritic syndrome and allergy:clinical studies[J].Arch Dis Child,1981,56:509-516

[3]Wheeler DC,Bernard DB.Lipid abnormalities in the nephrotic syndrome: causes,consequences,and treatment[J].Am J Kidney Dis,1994,23:331-346

[4]Shalhoub RJ.Pathogenesis of lipoid nephrosis:a disorderof T-cell function[J].Lancet,1974,2:556

[5]Audard V,Grimbert P,Valanciuté A,et al.Recent approaches to the pathogenesis of minimal change nephritic syndrome[J].Nephrologie,2002,23:367-369

[6]Van den Berg JG,Weening JJ.Role of the immune system in the pathogenesis of idiopathic nephrotic syndrome[J].Clin Sci,2004,107:125

[7]王崢,王增貴,劉震,等.多柔比星誘發(fā)大鼠腎病模型的實(shí)驗(yàn)研究[J].華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1990,21(4):430-432

[8]Okamura H,Tsutsi H,Komatsu T,et al.Cloning of a new cytokine that induces IFN-γ production by T cells[J].Nature,1995,378:88-91

[9]Tominaga K,Yoshimoto T,Torigoe K,et al.IL-12synergizes with IL-18 or IL-1 β for IFN-γproduction from human T cells[J].Int Immunol,2000,12:151-160

[10]Tomura M,Zhou XY,Maruo S,et al.A critical role for IL-18 in the proliferation and activation of N K1.1+ CD-3cells[J].J Immunol,1998,160:4738-4746

[11]Hyodo Y,Matsui K,Hayashi N,et al.IL-18 up- regulates perforin-mediated NK activity without increasing perforin messenger RN A expression by binding to constitutively expressed IL-18 receptor[J].J Immunol,1999,162:1662-1668

[12]王麗敏,張靜,羅巧華.多柔比星腎病大鼠 IL-18、IFN-γ及IL-4的表達(dá)及意義 [J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2011,34(3):66-67