大骨節(jié)病患者與健康人軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β mRN A的表達(dá)差異

李若飛,高大龍,涂忠民,楊雷剛,董舒,任軍龍,解俊杰,趙昕

(陜西省咸陽(yáng)市中心醫(yī)院骨一科,陜西 咸陽(yáng) 712000)

大骨節(jié)病(kaschin-bick disease,KBD)是一種病因不明的地方性慢性骨關(guān)節(jié)病,起病隱匿。中國(guó)國(guó)內(nèi)又叫矮人病、算盤(pán)珠病等,國(guó)際醫(yī)學(xué)界稱(chēng)本病為 Kaschin-Beck病。大骨節(jié)病在國(guó)外主要分布于西伯利亞?wèn)|部和朝鮮北部,在中國(guó)分布范圍大,從東北到西南的廣大地區(qū)均有報(bào)道,主要發(fā)生于黑、吉、遼、陜、晉等省,多分布于山區(qū)和半山區(qū),平原少見(jiàn)。本病在各個(gè)年齡組都有發(fā)生,但多發(fā)于兒童和青少年,成人很少發(fā)病,無(wú)明顯的性別差異。本病常常多發(fā)性、對(duì)稱(chēng)性侵犯軟骨內(nèi)成骨型骨骼,導(dǎo)致軟骨內(nèi)成骨障礙、管狀骨變短和繼發(fā)的變形性關(guān)節(jié)病。臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、增粗變形,肌肉萎縮,運(yùn)動(dòng)障礙[1,2]。其主要特征是青少年發(fā)育過(guò)程中軟骨內(nèi)化骨型的透明軟骨發(fā)生多發(fā)性灶狀軟骨壞死,并導(dǎo)致軟骨內(nèi)化骨障礙和繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)病。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),大骨節(jié)病屬于軟骨營(yíng)養(yǎng)不良性變化,包括軟骨萎縮、變性和壞死的病理過(guò)程,同時(shí)出現(xiàn)修復(fù)性適應(yīng)性變化,導(dǎo)致軟骨內(nèi)骨化型的透明軟骨(骺軟骨、骺板軟骨和關(guān)節(jié)軟骨)發(fā)生多發(fā)性灶狀壞死及繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)病。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因 子 -β(transform growth factor β ,TGF-β )是一大類(lèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化的因子,在許多器官或組織的生長(zhǎng)和分化中起著重要的作用[3-5]。現(xiàn)已證實(shí),TGF-β在軟骨發(fā)育過(guò)程中有提高硫酸化蛋白多糖、膠原、軟骨連接蛋白及堿性磷酸酶活性的作用。在軟骨細(xì)胞分化早期,促進(jìn)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞形成軟骨[6],但抑制終末細(xì)胞的肥大、分化及基質(zhì)礦化。其作用可以通過(guò)作用于細(xì)胞核的途徑來(lái)進(jìn)行[7]。有學(xué)者提出 TGF-β受體對(duì) TGF-β反應(yīng)性的喪失可促進(jìn)小鼠軟骨細(xì)胞的終末分化并導(dǎo)致類(lèi)似于人類(lèi)骨關(guān)節(jié)病的發(fā)展[8]。大骨節(jié)病晚期也有明顯的骨關(guān)節(jié)病改變,而大骨節(jié)病軟骨 TGF-β基因水平表達(dá)方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)這方面進(jìn)行了初步的探索,以進(jìn)一步闡明大骨節(jié)病的發(fā)病機(jī)理。

1 材料與試劑

1.1 時(shí)間地點(diǎn) 本實(shí)驗(yàn)在 2009年 12月至 2011年2月在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2 對(duì)象 大骨節(jié)病和正常對(duì)照關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本各 5例。大骨節(jié)病關(guān)節(jié)軟骨取自咸陽(yáng)市第二人民醫(yī)院對(duì)大骨節(jié)病患者實(shí)施膝關(guān)節(jié)清理術(shù)后的關(guān)節(jié)軟骨,其中男 3例 ,女 2例,年齡39～57歲。正常組軟骨標(biāo)本取自于咸陽(yáng)市中心醫(yī)院因車(chē)禍等意外原因所致關(guān)節(jié)骨折手術(shù)所取軟骨,其中男3例,女2例,年齡28～54歲。納入標(biāo)準(zhǔn):a)大骨節(jié)病標(biāo)本符合國(guó)內(nèi)大骨節(jié)病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(GB16003-1995)診斷。b)兩組標(biāo)本軟骨均取自膝關(guān)節(jié)。 c)根據(jù)國(guó)務(wù)院《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》規(guī)定 ,患者或家屬對(duì)標(biāo)本收集及用途均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):遺傳性、退行性骨關(guān)節(jié)炎和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

1.3 主要試劑 DNA marker購(gòu)自 Takara公司;DN A凝膠回收試劑盒購(gòu)自 Omega公司;細(xì)胞總 RN A提取試劑盒、cDN A合成試劑盒購(gòu)自M BI公司;引物合成及基因測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成;其他生物化學(xué)試劑和耗材購(gòu)自西安潤(rùn)德生物工程公司。

2 方法與步驟

2.1 提取軟骨細(xì)胞總 RNA 選擇 5位 KBD患者和5位健康人的軟骨組織,按照 FAST200總 RNA提取試劑盒操作,得到5種總RNA,分別命名為 RN A-K1/2/3/4/5和 RN A-N1/2/3/4/5?？?RNA提取步驟(以 1個(gè)樣本為例):a)樣品預(yù)處理:將軟骨研碎,胰酶消化細(xì)胞后,留下細(xì)胞團(tuán)塊和適量上清(2×106細(xì)胞/100μL),充分震蕩致細(xì)胞團(tuán)塊松散,放入新的無(wú)菌無(wú)酶的eppendorf管中。b)處理好的樣品中加入RA2液500 μL,充分顛倒 1 min。 c)將樣品裂解物倒入或吸入內(nèi)套管,4℃、12000 rpm離心1 min。d)棄外套管內(nèi)液體,內(nèi)套管中加入 500μL洗液,4℃、12000rpm離心 1min。e)重復(fù)上步驟條件洗滌一次。f)棄外套管內(nèi)液體,內(nèi)套管中不加入洗液,4℃、12000 rpm離心 1 min。g)將內(nèi)套管放入新的無(wú)菌無(wú)酶的eppendorf管 ,在膜中央加入 25μL洗脫液。室溫靜置1min,離心 1min,得到 25μL總 RN A。

2.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 分別以10份軟骨細(xì)胞所提取的總RN A為模板,用 MBI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到10種 cDNA產(chǎn)物,命名為 RT-K1/2/3/4/5和 RT-N1/2/3/4/5。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作步驟 (以1個(gè)樣本為例):a)0.2mL無(wú)菌無(wú)酶的 PCR反應(yīng)管中依次加入 5μL總 RNA、1 μL Random hexamer primer和6μL Depc-H2O,共12μL體系?；靹螂x心,70℃反 應(yīng) 5min。 b)加 入 4 μL5× reaction buffer、 2μL dNTPmix和1μL Ribolock,共 19μL體系?；靹螂x心,25℃反應(yīng) 5 min。c)加入 1μL M-Mμlv?；靹螂x心,25℃反應(yīng) 10 min,42℃反應(yīng) 60min,70℃反應(yīng) 10min,得到 20μLcDNA產(chǎn)物。

2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) Genebank查詢(xún)得到人 TGF-β的基因序列,其 Gene ID為NM-000660。設(shè)計(jì)針對(duì) TGF-B基因的特異引物 ,擴(kuò)增基因片段位于 TGF基因的981～1230,大小為250bp。同時(shí)設(shè)計(jì) 1對(duì)針對(duì)人β-actin的引物,作為內(nèi)參,擴(kuò)增基因片段大小為146 bp。將設(shè)計(jì)好的引物序列交由上海生工生物公司合成。TGF-β引物序列如下。上游 TGF-P1:5′-CAAGACT ATCGACATGGAGC-3′; 下 游 TGF-P2:5′-GGTT TCCACCATT ACACGC-3′。β-actin引物序列如下。上游 actin-P1:5′-CTATCGGCAATGAGCGGT TCC-3′;下 游actin-P2:5′-TGTGT TGGCATAGAGGTCTTT ACG-3′

2.4 Pcr擴(kuò)增TGF-β基因 選擇西安潤(rùn)德生物公司生產(chǎn)的2× PCR Mix反應(yīng)體系。以10份軟骨細(xì)胞所提取的總 RN A逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA為模板,利用特異引物 actin-P1/P2和TGF-P1/P2擴(kuò)增目的基因,得到 10種actin和10種 TGF-β的PCR產(chǎn)物。分別命名為 PCR actin-K1/2/3/4/5、PCR TGFK1/2/3/4/5、PCR actin-N1/2/3/4/5和 PCR TGF-N1/2/3/4/5。

反應(yīng)體系為(50μL):PCR Mix25μL,上下游引物 P1、P2各 1μL,cDNA 2μL,ddH2O 21μL。 反應(yīng)條件:預(yù)熱 94℃5 min,循環(huán) 94℃ 30 sec、55℃ 30 sec、 72℃ 30 sec(35 cycles),后延伸 72℃ 3min。

2.5 瓊脂糖凝膠電泳以及圖像分析 取20種RT-PCR產(chǎn)物各5μL,分別加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔內(nèi),以100 bp DNA marker作為參照。直流電 100V電泳 30 min。在紫外燈下觀測(cè)電泳條帶位置并照像。利用圖像處理軟件分析各條帶灰度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn),設(shè)定P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與分析

3.1 RT-PCR電泳圖像 見(jiàn)圖1～2。

3.2 圖像分析測(cè)定mRN A表達(dá)差異 利用圖像處理軟件分析 RT-PCR各條帶灰度,以β-actin為參照,計(jì)算相對(duì)灰度值,如圖3所示,可見(jiàn)大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞的 TGF-β表達(dá)低于健康成人。

大骨節(jié)病患者 TGF-β RT-PCR相對(duì)灰度值為 0.8262±0.0361,健康成人為1.3628±0.1011,用 SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用t檢驗(yàn)分析t=11.1732,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞 RT-PCR電泳圖像

圖2 健康人軟骨細(xì)胞 RT-PCR電泳圖像

圖3 不同個(gè)體軟骨細(xì)胞 TGF-β表達(dá)的變化

4 討 論

大骨節(jié)病是一種原因不明的地方性骨關(guān)節(jié)性疾病。在我國(guó)、前蘇聯(lián)、日本、朝鮮等國(guó)均有該病的報(bào)道。 KBD的病因說(shuō)之一即是生物地球化學(xué)說(shuō)[9,10],它指的是外環(huán)境水、土、糧低硒,但是環(huán)境低硒不是其特異性致病因子,多項(xiàng)研究表明是多種細(xì)胞因子的共同作用。以往研究表明,炎癥細(xì)胞因子在骨關(guān)節(jié)病的發(fā)病中具有重要的作用。如白細(xì)胞介素-1可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)翳的形成,也可通過(guò) RAN K/RAN KL破壞骨和軟骨。腫瘤壞死因子通過(guò)上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1的表達(dá),可誘導(dǎo)核因子κ B活化。關(guān)節(jié)滑膜中的腫瘤壞死因子可活化內(nèi)皮細(xì)胞,刺激纖維母細(xì)胞分化,并可誘導(dǎo)金屬蛋白酶以及白細(xì)胞介素-1、白細(xì)胞介素-6等的產(chǎn)生,以及通過(guò)白細(xì)胞介素-1間接引起組織的損傷[11-14]。白細(xì)胞介素-1、TNF在軟骨損傷過(guò)程中,可激活基質(zhì)降解酶,促進(jìn)軟骨基質(zhì)分解,刺激關(guān)節(jié)局部炎性、免疫反應(yīng)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)家族包括結(jié)構(gòu)相似而功能不同的五個(gè)多肽成員,有激動(dòng)劑、抑制劑和苗勒管抑制物質(zhì)等。大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞都具有分泌TGF的功能。在體內(nèi),大多數(shù)的細(xì)胞都可表達(dá) TGF受體(TGF-R)[15]。 TGF-β是 TGF家族成員之一,是一種二聚體多肽,具有多種生物功能。研究表明,TGF廣泛參與體內(nèi)各種病理生理過(guò)程,對(duì)細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、血管生成、纖維化、細(xì)胞凋亡及機(jī)體免疫系統(tǒng)均有著重要作用[16]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(tromsforming growth factor-β,TGF-β)是一種多肽、廣泛存在于正常組織中,尤其以骨組織中含量最為豐富,TGF-β在調(diào)節(jié)骨代謝、骨改建過(guò)程中發(fā)揮重要作用,它調(diào)節(jié)多種細(xì)胞如成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的增殖和分化,并影響骨基質(zhì)合成[17]。大骨節(jié)病患者發(fā)病多始于兒童期,在成人表現(xiàn)明顯。其發(fā)病與骨關(guān)節(jié)炎有相似之處。在骨細(xì)胞的分化生長(zhǎng)中,需要轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的調(diào)節(jié)。而大骨節(jié)病的骨細(xì)胞分化顯然是存在障礙的。這與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子的缺乏存在一定的關(guān)系。 TGF-β在體內(nèi)沒(méi)有明顯骨誘導(dǎo)作用,但體外實(shí)驗(yàn)表明 TGF-β能夠刺激體外培養(yǎng)的骨祖細(xì)胞增殖,能夠促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化[18]。在成骨細(xì)胞上分布著高親和力的TGF-β 受體,受 TGF-β的刺激后,可合成大量基質(zhì)。 TGF-β最初刺激成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的有絲分裂,使其增殖分化為成骨細(xì)胞,增加骨鈣含量。

從大骨節(jié)病的表現(xiàn)看,其主要累及關(guān)節(jié)軟骨、骨骺端的生長(zhǎng)發(fā)育,病理表現(xiàn)為透明軟骨變性壞死。既往的研究表明,軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的成熟分化過(guò)程中,需要包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子在內(nèi)的眾多細(xì)胞因子的參與和調(diào)節(jié)。TGF-β能夠促進(jìn)骨及軟骨分化、改建等過(guò)程。大骨節(jié)病患者軟骨細(xì)胞中細(xì)胞因子的缺乏,與其發(fā)病存在一定的聯(lián)系。在基因水平,TGF-β的表達(dá)在健康人和大骨節(jié)病患者中的差異,需要用實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)從 mRNA水平驗(yàn)證了 TGF-β在大骨節(jié)病患者和健康人軟骨中的表達(dá)是不同的。大骨節(jié)病患者軟骨中TGF-β的表達(dá)低于健康人群。在正常軟骨發(fā)生過(guò)程中,TGF-β1,TGF-β 2,TGF-β 3在軟骨細(xì)胞的表層,過(guò)渡層及成熟度很低的細(xì)胞層中表達(dá)強(qiáng)烈。大骨節(jié)病病理改變主要表現(xiàn)為深層軟骨細(xì)胞的壞死,這提示隨著壞死細(xì)胞的增多,TGF-β的表達(dá)減弱。有文獻(xiàn)報(bào)道,TGF-β可通過(guò)增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞合成的活性等一系列作用參與軟骨修復(fù)過(guò)程。這一結(jié)論的得出,為我們下一步研究大骨節(jié)病的發(fā)病機(jī)制,進(jìn)而為治療大骨節(jié)病奠定了基礎(chǔ)。

本研究的缺點(diǎn)之一在于病例數(shù)偏少,難以覆蓋大樣本人群,在以后的研究中,將盡可能擴(kuò)大樣本量,以減少偏倚;另一缺點(diǎn)在于未能從蛋白水平加以驗(yàn)證,這將是下一步研究的目標(biāo)和重點(diǎn)工作。

[1] 曹小剛 ,呂曉亞,徐綱要,等.2002年陜西省大骨節(jié)病現(xiàn)況調(diào)查 [J].地方病通報(bào),2003,18(3):27-29.

[2] 楊建伯.成人大骨節(jié)病病情動(dòng)態(tài)及防治效果觀察的標(biāo)志與方法 [J].中國(guó)地方病學(xué)志,2003,22(6):512-516.

[3] Jiang YX,Tang SY,Wu XP,et al.Biochemical markers of age-related changes in bones turnover and bone mineral density in healthy Chinese men[J].Zhongnan Daxue Xuebao Yixue Ban,2008,33(1):53-56.

[4] Wu N,Wang QP,Wu X P,et al.Relationships between serum adiponectin,leptin concentrations and bone mineral density,and bone biochemical markers in Chinese women[J].Clin Chim Acta,2010,411(9-10):771-775.

[5] Zhang H,Xie H,Zhao Q,et al.Relationships between serum adiponectin,apelin,leptin,resistin,visfatin levels and bone mineral density, and bone biochemical markers in post-menopausal Chinese women[J].J Endocrinol Invest,2010,33(10):707-711.

[6] Zhang N,Wu XY,Wu XP,et al.Relationship between age-related serum concentrations of TGF-β et al and TGF-β eta and those of osteoprotegerin and leptin in native Chinese women[J].Clin Chim Acta,2009,403(1-2):63-69.

[7] Akinci B,Bayraktar F,Saklamaz A,et al.Low transforming growth factor-betal serum levels in idiopathic male osteoporosis[J].J Endocrinl Invest,2007,30(5):350-355.

[8] Mcguiqan FE,Macdonald HM,Bassiti A,et al.Large-scale population-based study shows no association between common polymorphisms of the TGF-β 1gene and BMD in women[J].Bone Miner Res,2007,22(2):195-202.

[9] 郭雄.大骨節(jié)病軟骨細(xì)胞發(fā)生壞死的分子生物學(xué)機(jī)制[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,26(3):201-204.

[10] 王治倫.大骨節(jié)病 4種病因?qū)W說(shuō)的同步研究 [J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(1):1-7.

[11] 曹姣妃,劉寧,梁德勝,等.急性腦血管病患者血清的hs2CRP、TNF-α和 IL-6動(dòng)態(tài)變化及臨床意義 [J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(2):173-175.

[12] 滕海,白希壯,周毅,等.幾種細(xì)胞因子在骨關(guān)節(jié)炎病理生理中的作用[J].解剖科學(xué)進(jìn)展,2004,10(1):76-79.

[13] Fernandes JC,Martel2,Pelletier JP.The role of cytokines in osteoarthritis physiology [J].Biorheology,2002,39(1-2):237-246.

[14] 朱參勝,馮清華,于曰祥,等.大骨節(jié)病患者血清促炎癥細(xì)胞因子水平的檢測(cè)[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22(1):84-85.

[15] Langdahle BL,Uitterlindenb AG,Ralston SH.Largescale analysis of association between polymorphisms in the transforming growth factor beta1 gene(TGFB1)and osteoporosis:The GENOMOS study[J].Bone,2008,42(5):969-981.

[16] Zgoda M,Gorecki A,Bartlomiejczyk I,et al.Femoral neck fracture is accompanied by local changes in the content of transforming growth factor-betal,interleukin-1beta and collagenase activity[J]. J Musculoskelet Neuronal Interact,2007,7(2):161-165.

[17] Kveiborg M,Flyvbjerg A,Eriksen EF,et al.Transforming growth factor betal stimulates the production of insulin-like growth factor-I and insulin-like growth factor-bingding protein-3in human bone marrow stromal osteoblast progenitors[J].Endocrinol,2001,169(3):549-561.

[18] Bonewald LF,Mundy GR.Role of transforming growth factor beta in bone remodeling[J].Clin Orthop,1990(250):261.