稀薟上雙生病毒的分子鑒定技術(shù)研究

董志輝

(遼寧省沈陽市蘇家屯區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，遼寧沈陽220101)

1 引言

粉虱傳雙生病毒(Whitefly transmitted geminivirus，WTG)是一類廣泛發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)植物上的具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈DNA病毒。在分類上屬雙生病毒科(Geminiviridae)的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)。該屬的大多數(shù)病毒是雙組份雙生病毒，其基因組為兩條長度相似(每條約2.8kb)的閉合環(huán)狀ssDNA分子，分別為DNA－A和DNA－B。少數(shù)病毒為單組分雙生病毒，僅有一個DNA－A組分［1］。目前，在亞洲和非洲等許多國家的單組份begomoviruses上發(fā)現(xiàn)了伴隨有DNAβ的病害復(fù)合體。DNAβ對于begomoviruses誘導(dǎo)典型癥狀是必需的，并可能在決定病毒寄主范圍中起重要作用，為病毒適應(yīng)更多的寄主提供了機會［2～5］。我國自 1982 年報道［6］發(fā)現(xiàn)雙生病毒以來，在云南、海南、廣西、和廣東等18省區(qū)的番茄、番木瓜、煙草和番薯等已相繼發(fā)現(xiàn)多種雙生病毒［7～11］。雙生病毒在我國的危害日益嚴(yán)重，隨著全球氣候變暖、農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境變化、煙粉虱賴以越冬的地域不斷北移以及交通、旅游、農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易全球化等因素，我國雙生病毒發(fā)生地區(qū)不斷北移，并給生產(chǎn)上造成較大的損失［12］。本文對從福建漳州稀薟(Siegesbeckia orientalis)上采集到具典型雙生病毒癥狀的樣品進行了分子檢測，并對序列進行了分析。

2 實驗方法

2.1 植物樣品

2012年2月，在福建漳州地區(qū)采集到表現(xiàn)雙生病毒的典型黃脈癥狀稀薟樣品。

2.2 DNA提取及PCR擴增

利用CTAB法提取的稀薟病樣總DNA作為模板［13］。利用引物 PA/PB［11］(TAATATTACCKGWKGVCCSC/TGGACYTTRCAWGGBCCGCACA)擴增雙生病毒基因組DNA－A的部分序列，根據(jù)測出的序列設(shè)計引物FJ12F/R(ACAGAATGTACAAAAGCCCTGA/ATCTGCTGGTCGCTTC GACAT)擴增近全長的DNA－A，擴增的PCR產(chǎn)物克隆至pMD－18T Vector，測序。利用通用引物PCRC1/PBL1V 2040［14］(CTAGCTGCAGCATATTTACRARWATGCC/ACCTCTGCAGCARTGRTCCKATYTTCATAC)擴增雙生病毒DNA－B組分。利用通用引物Beta01/02(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCC AGGGGTACAC)［15］擴增雙生病毒伴隨衛(wèi)星DNAβ分子。利用通用引物DNA101/102(GTAGGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC/AGTGGTACCTACCCTCCCAGGGGTAC AC)［16］擴增雙生病毒伴隨衛(wèi)星DNA1分子。

2.3 序列分析

序列測定由上海生物工程有限公司完成。數(shù)據(jù)處理借助 DNAStar軟件(DNASTAR Inc.，Madison，USA)和 DNAMAN Version 6.0(Lynnon Biosoft，Quebe Canad)進行。利用BLAST程序在GeneBank數(shù)據(jù)庫中尋找與DNA－A和DNAβ序列最相近的基因組序列。采用DNAStar分析軟件(Madison，Wis.，U.S.A)中 ClustalV方法對DNA－A和DNAβ序列的核苷酸或者氨基酸的相似性進行分析。采用Mega4.0臨近法繪制親緣關(guān)系樹，設(shè)置種子重復(fù)數(shù)是1000［17］。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 病毒基因組DNA－A的分子特征

FJ12 DNA－A全長2770nts，具有典型的雙生病毒基因組結(jié)構(gòu)，即編碼6個開放讀碼框架(ORFs)，其中病毒鏈編碼AV1(CP)和AV2兩個ORFs，互補鏈編碼AC1(Rep)、AC2、AC3和 AC4共4個 ORFs。DNA －A 還含有一個較長的非編碼區(qū)，又稱基因間隔區(qū)(Intergenic Region，IR)，并含有保守序列TAATATTAC及TATA盒(核苷酸2672－2675位)，還有重復(fù)序列GGTGTC(核苷酸2625－2631位，重復(fù)于核苷酸2654－2659位和2661－2666位，反方向重復(fù)于核苷酸2654－2659位2680－2685)，該重復(fù)序列是復(fù)制酶蛋白的結(jié)合位點。

從全基因組看，相似性與稀薟黃脈病毒的同源性最高，為95.7%，其次與中國番木瓜曲葉病毒PaLCuCNV的相似性較高，為76.8%。而FJ12 IR除了與稀薟黃脈病毒的同源性最高為86.8%外，與其它begomoviruses的相似性都很低，只有39.9% ～58.6%。對編碼的蛋白序列進行比較時，F(xiàn)J12編碼的6個基因都與SbYVV的同源性最高，其中 AV1為96.6%，AV2為95.3%，AC1為97.3%，AC2 為 91.2%，AC3 為 94.0%;AC4 為93.8%(表1)。

表1 FJ12DNA－A與其他雙生病毒DNA－A核苷酸和氨基酸序列的相似性比較 %

病毒DNA-A IR AV1 AV2 AC1 AC2 AC3 AC4 TbCSV 72.2 58.6 80.9 62.6 85.0 56.0 69.4 77.3 TbLCJV 70.0 44.8 76.5 66.4 80.6 59.3 71.6 73.2 ToLCGdV 76.2 50.5 95.3 76.7 84.2 60.0 69.4 74.2 ToLCVV 75.9 55.8 95.3 73.3 84.5 56.3 61.2 76.3 TYLCCNV 72.8 54.9 80.1 68.7 83.9 57.5 74.6 78.4 SbYVV 95.7 86.8 97.3 96.6 95.3 91.2 94.0 93.8

為了進一步明確這FJ12分離物與其它病毒的系統(tǒng)親緣關(guān)系，筆者構(gòu)建了基于DNA－A核苷酸序列的系統(tǒng)關(guān)系樹(圖1A)。從圖上可看出，與序列比較的結(jié)果相似，F(xiàn)J12在系統(tǒng)樹上與SbYVV聚類在一起，稀薟黃脈病毒進化關(guān)系相對其它begomoviruses較近。

根據(jù)雙生病毒科分類標(biāo)準(zhǔn)，即病毒全基因組核苷酸序列同源性小于89%，往往定名為不同病毒，大于89%，則認(rèn)為是同一病毒的不同株系［1］。以上分析結(jié)果表明:FJ12 DNA－A是稀薟黃脈病毒在福建的一個新的分離物。

3.2 衛(wèi)星DNAβ分子的分子特征

利用特異性引物beta01/beta02擴增到約1300 bp的片段，經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)是DNAβ分子(FJ12β)。FJ12β全長為1331 nts，具有典型的伴隨衛(wèi)星分子的基因組結(jié)構(gòu):含有一個保守的ORF，是編碼116個氨基酸的βCl基因;含有一個保守的SCR區(qū)，并在SCR的3’端具有九核苷酸TAATATT/AC;一個富含腺嘌呤A的區(qū)域(A－rich region)，序列的位置在717～979nts，其中A含量達到51.0～52.5%，A的重復(fù)數(shù)最高為7個。

序列比較分析結(jié)果顯示，F(xiàn)J12β與已知的衛(wèi)星分子的同源性都很低，只有30.6% ～70.2%。其中，F(xiàn)J12β與 SbYVV DNAβ相似性最高，為70.2%。βCl相似性也與SbYVV DNAβ最高，為92.2%，其余都在25.0% ～44.8%之間。SCR是 DNAβ 分子中最保守的區(qū)域，其相似性為74.8% ～97.0%，其中與SbYVV DNAβ最高，為97.0%。這說明稀薟樣品中的DNAβ分子確實可以用保守的SCR區(qū)作為探針檢測到，但它是一類全新的DNAβ分子，伴隨于稀薟樣品中發(fā)現(xiàn)的DNA－A(表2)。

表2 FJ12β與其他DNAβ的全長核苷酸及βC1編碼的氨基酸序列相似性比較 %

為了進一步明確這FJ12β與其它衛(wèi)星分子的系統(tǒng)親緣關(guān)系，構(gòu)建了基于DNAβ核苷酸序列的系統(tǒng)關(guān)系樹(圖B)。從圖上可看出，與序列比較的結(jié)果相似，F(xiàn)J12在系統(tǒng)樹上與SbYVV聚類在一起成一個小分支，與稀薟黃脈病毒進化關(guān)系相對其它begomoviruses較近。

圖1 FJ12DNA－A和其他雙生病毒全長核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(A)FJ12β和其他雙生病毒DNAβ全長核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)關(guān)系樹(B)

根據(jù)雙生病毒科衛(wèi)星分子分類標(biāo)準(zhǔn)，即病毒衛(wèi)星分子全基因組核苷酸序列同源性小于78%，往往定名為不同病毒，大于78%，則認(rèn)為是同一病毒衛(wèi)星的不同株系［18］。以上分析結(jié)果表明，F(xiàn)J12 DNAβ是雙生病毒伴隨衛(wèi)星的一個新種，建議命名為福建稀薟黃脈病毒伴隨衛(wèi)星分子。

4 結(jié)語

(1)FJ12稀薟樣品都由雙生病毒侵染，該病毒是單組份雙生病毒，基因組由一個DNA－A組分(FJ12DNA－A及其伴隨衛(wèi)星DNAβ分子(FJ12DNAβ)組成。不含有 DNA－B和 DNA－1組分;

(2)FJ12 DNA－A全基因組的核苷酸序列與稀薟黃脈病毒的同源性最高，為95.7%。根據(jù)雙生病毒分類標(biāo)準(zhǔn)，說明FJ12稀薟樣品上的雙生病毒為稀薟黃脈病毒在福建的一個新的分離物。

(3)FJ12DNAβ分子全基因組的核苷酸序列與稀薟黃脈病毒伴隨衛(wèi)星的同源性最高，為70.2%。根據(jù)雙生病毒伴隨衛(wèi)星的分類標(biāo)準(zhǔn)，說明FJ12DNAβ是一個新型的衛(wèi)星分子，我們推薦將其命名為福建稀稀薟黃脈病毒伴隨衛(wèi)星分子。

(4)進化樹分析顯示，F(xiàn)J12 DNA－A和FJ12DNAβ都與稀薟黃脈病毒的親緣關(guān)系最近，推測DNA－A在進化過程中捕獲了其他植物或病毒的分子后，重組得到新的DNAβ分子。

［1］Fauquet CM，Briddon RW，Brown JK，et al.Geminivirus strain demarcation and nomenclature［J］.Arch Virol，2008(153):783～821.

［2］Briddon R W，Markham P G.Cotton leaf curl disease［J］.Virus Res，2001(71):151 ～159.

［3］Zhou X P，Xie Y，Tao X R，et al.Characterization of DNAβ associated with begomoviruses in China and evidence for coevolution with their cognate viral DNA － A［J］.Gen Virol，2003(84):237～247

［4］Zhou X P，Xie Y，Zhang Z K，et al.Molecular characterization of a novel defective DNA isolated from tobacco tissues infected with tobacco leaf curl virus［J］.Acta Virologica，2001(45):45 ～ 50.

［5］Xie Y，Zhou X P，Li G X.Molecular characterization of Tomato yellow leaf curlChina virus and its satellite DNA isolated from tobacco［J］.Chinese Science Bulletin，2003，48(8):766～770

［6］龔祖隕，沈菊英，鄭巧兮，等.我國第一例雙聯(lián)病毒—煙草曲葉病毒的分離及電鏡檢定［J］.科學(xué)通報，1982，22(13):93～96.

［7］洪益國，蔡健和，王小鳳，等，中國南瓜曲葉病毒——一個雙生病毒新種［J］.中國科學(xué)，1994，24(6):605～608.

［8］劉玉樂，蔡健和，李冬玲，等.中國南瓜曲葉病毒:一個雙生病毒新種［J］.中國科學(xué)，1998，24(7):608～613.

［9］劉玉樂，蔡健和，李冬玲，等.中國番茄黃花曲葉病毒——雙生病毒的一個新種［J］.中國科學(xué)，1998，28(2):148～153.

［10］李正和，謝 艷，李桂新，等.云南番茄曲葉病是由煙草曲頂病毒引起的［J］.病毒學(xué)報，2002，18(4):355～361

［11］Zhou X P，Xie Y，Zhang Z K.Molecular characterization of distinct begomovirus infecting tobacco in Yunnan［J］.Arch Virol，2001(146):1 599～1 606

［12］Luan Y S，Zhang J，Liu D M，et al.Molecular characterization of sweet potatoleaf curl virus isolate from China(SPLCV－CN)and its phylogenetic relationship with other members of the members of the Geminiviridae［J］.Virus Genes，2007(35):379 ～ 385.

［13］謝 艷，張仲凱，李正和，等.粉虱傳雙生病毒的TAS－ELISA及PCR快速檢測［J］.植物病理學(xué)報，2001，32(2):182～186

［14］Rojas M R，Gilbertson R L，Russell D R，et al.Use of degenerate primers in the polymerase chain－reaction to detect whiteflytransmitted geminiviruses［J］.PlantDisease，1993(77):340 ～347

［15］Briddon RW，Bull SE，Mansoor S，etal.Universalprimers for the PCR－mediated amplification of DNAβ:a molecule associated with some monopartite begomoviruses［J］.Biotechol，2002(20):315～318.

［16］謝 艷.雙生病毒及伴隨小分子DNA的基因組結(jié)構(gòu)與變異研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2003.

［17］Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4:Mo － lecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)Software Version 4.0［J］.Molecular Biology and Evolution，2007(24):1596～1599.

［18］Briddon RW，Brown JK，Moriones E.Recommendations for the classification and nomenclature of the DNA－βsatellites of begomoviruses［J］.Arch Virol，2008(153):763 ～781.