光葉娃兒藤鎮(zhèn)痛抗炎作用的實驗研究

楊超燕 陳艷芬 陶曙紅 唐春萍 崔紅花

廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州 510006

光葉娃兒藤為蘿藦科 (Asclepiadaceac)娃兒藤屬(Tylophora)的多年生匍匐性藤狀草本植物，主要分布于臺灣和廣東［1］，在民間廣泛應用于治療感冒發(fā)熱，咽喉腫痛等，且療效顯著。但目前國內(nèi)外尚未見其藥理作用報道。本研究根據(jù)光葉娃兒藤的臨床主治，分別采用小鼠熱板法、醋酸致扭體法和甲醛致痛法，觀察其鎮(zhèn)痛作用;用二甲苯所致小鼠耳廓腫脹法及甲醛致小鼠足跖腫脹法觀察其抗炎作用。為本品在應用上呼吸道感染疾病的應用提供實驗依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 藥材

光葉娃兒藤全草采于廣東吳川，經(jīng)中國科學院華南植物研究所標本館葉華谷研究員鑒定為蘿藦科娃兒藤屬的光葉娃兒藤 (Tylophora ovata(Lindl.)Hook.ex Steud.var.brownii(Hay.)Tsiang et P.T.Li)，標本存放于中國科學院華南植物研究所標本館。

1.2 藥品及試劑

稱取光葉娃兒藤鮮品200 g，切段，置燒杯中加入大約10倍體積的水煎煮3次，每次0.5 h，提取液合并過濾、濃縮光葉娃兒藤水提取物濃縮液 (相當于2.4 g生藥/mL)，給藥前配成所需濃度;冰醋酸 (分析純，天津市富宇精細化工有限公司，批號:110920);甲醇 (分析純，天津市百世化工有限公司，批號:20100630);甲醛 (廣州市化學試劑廠，批號:20120204－1);二甲苯 (廣州市化學試劑廠，批號:0509071);氫氧化鉀 (天津市福晨化學試劑廠，批號:20120210);羅通定片 (四川康福來藥業(yè)集團有限公司，批號:100301);吲哚美辛片 (廣東華南藥業(yè)有限公司，批號:110601);羧甲基纖維素鈉 (天津市百世化工有限公司，批號:20100908)。

1.3 動物

SPF級NIH小鼠，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2008－0002，正常飼養(yǎng)3 d后供試。

1.4 儀器

UV－1800紫外分光光度計 (北京瑞利分析儀器公司);AY－120電子分析天平 (島津儀器公司)。

2 方法

2.1 鎮(zhèn)痛作用

2.1.1 對小鼠熱板痛閾值的影響［2］

以55±0.5℃熱板篩選痛閾值在5－30 s的雌性小鼠，隨機分成4組:正常對照組，羅通定陽性組，光葉娃兒藤高、低劑量組。每組每天ig相應的藥物，灌胃容積20 mL/Kg，對照組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)給藥7天。末次給藥后1、2h測量各組小鼠的痛閾值 (若60s內(nèi)無痛覺反應，按60s計算)。

2.1.2 對醋酸所致小鼠扭體實驗的影響［3］

取NIH小鼠48只，雌雄各半，隨機分成4組:正常對照組，引哚美辛陽性組，光葉娃兒藤高、低劑量組。每組每天ig相應的藥物，灌胃容積20 mL/Kg，對照組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)給藥7天。于末次給藥后1 h，各小鼠分別腹腔注射0.7%冰醋酸0.2 mL/只，觀察并計記錄15 min內(nèi)的扭體次數(shù)。

2.1.3 對小鼠甲醛致痛實驗的影響［4］

取NIH小鼠48只，雌雄各半，隨機分成4組:正常對照組，引哚美辛陽性組，光葉娃兒藤高、低劑量組。每組每天ig相應的藥物，灌胃容積20 mL/Kg，對照組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)給藥7天。于末次給藥后1 h，用2.5%甲醛生理鹽水溶液50 uL/只皮下注射小鼠右后足鍵膜下(從后肢足掌心向踝關(guān)節(jié)方向進針，皮下給藥)，置大燒杯中，分別記錄注射后0～10 min(第Ⅰ時相)和15～30 min(第Ⅱ時相)兩個時間段小鼠累計舔足時間。

2.2 抗炎作用

2.2.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響［5］

取NIH小鼠48只，雄性，隨機分成4組:正常對照組，引哚美辛陽性組，光葉娃兒藤高、低劑量組。每組每天ig相應的藥物，灌胃容積20 mL/Kg，對照組給予等容量的生理鹽水，各實驗組連續(xù)給藥7天，于末次給藥后1 h，在小鼠右耳背腹兩側(cè)均勻涂布二甲苯50μL致炎，30 min后脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩耳，取樣用直徑為6 mm的不銹鋼打孔器，分別在左、右耳同一部位打下圓耳片，精密稱重，以左、右耳片重量之差作為腫脹度。

2.2.2 甲醛致小鼠足腫及組織中PGE2含量測定實驗［6］

取NIH小鼠48只，雄性，隨機分成4組:正常對照組，引哚美辛陽性組，光葉娃兒藤高、低劑量組。每組每天ig相應的藥物，灌胃容積20 mL/Kg，對照組給予等容量的生理鹽水，連續(xù)給藥7天。末次給藥后1h，各小鼠右后足跖皮下注射2.5%甲醛生理鹽水溶液50μL/只，1 h后處死，從踝關(guān)節(jié)處對稱剪下左右后足，精密電子天平稱量，計算腫脹度 (mg)。取已稱重的右后足，剪碎，加入生理鹽水5 mL浸泡1 h，離心浸泡液15 min(3 000 r·min－1)，取上清液0.5 mL，加入0.5 mol/L KOH甲醇液2 mL，在50℃水浴中異構(gòu)化20 min，加入甲醇稀釋至5 mL后，用紫外分光光度計在278 nm處測定吸光度值。按下式計算PGE2含量 (ug/g)。PGE2(ug/g)=A278×13.13 ×D ×V/炎足爪重 (V－PGE2溶液體積、D稀釋倍數(shù)，其中，V=5 mL、D=10);腫脹度 (mg)=右足重 (mg)－左足重(mg)。

3 統(tǒng)計學處理

計量資料以 (x±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件，組間顯著性差異用方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 鎮(zhèn)痛作用

4.1.1 對小鼠熱板痛閾值的影響

和對照組比較，光葉娃兒藤高和低劑量組在藥后1h和2h都不能顯著延長小鼠熱板痛閾值，沒有顯著性差異。結(jié)果見表1。

表1 光葉娃兒藤對小鼠熱板痛閾值的影響 (x±SD，n=12)

4.1.2 對醋酸所致小鼠扭體實驗的影響

和對照組比較，光葉娃兒藤高劑量組小鼠扭體次數(shù)明顯少于生理鹽水對照組，差異有顯著性意義 (P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表2 光葉娃兒藤對醋酸所致小鼠扭體實驗的影響 (x±SD，n=12)

4.1.3 對小鼠甲醛致痛實驗的影響

和對照組比較，光葉娃兒藤高劑量組對甲醛引起疼痛的第二時相有顯著鎮(zhèn)痛作用 (P＜0.01)，低劑量組作用不明顯。結(jié)果見表3。

表3 光葉娃兒藤對小鼠甲醛致痛實驗的影響 (x±SD，n=12)

4.2 抗炎作用

4.2.1 對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響

和對照組比較，光葉娃兒藤高和低劑量組對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹均有顯著抑制作用 (P＜0.01)。結(jié)果見表4。

表4 光葉娃兒藤對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響 (x±SD，n=12)

4.2.2 對甲醛致小鼠足腫脹及足組織中PGE2含量的影響

和對照組比較，光葉娃兒藤高和低劑量組對甲醛致小鼠足腫脹及足組織中PGE2含量均有顯著抑制作用 (P＜0.05);對PGE2含量影響呈量效關(guān)系，高劑量組和低劑量組比較有顯著性差異 (P＜0.05)。結(jié)果見表5。

表5 光葉娃兒藤對甲醛致小鼠足腫脹及足組織中PGE2含量的影響 (x±SD，n=12)

5 討論

研究鎮(zhèn)痛藥物常用的實驗方法有熱板法、扭體法與甲醛法。熱板法主要用于中樞性鎮(zhèn)痛藥的篩選，扭體法主要反映外周性鎮(zhèn)痛，小鼠足鍵膜皮下注射甲醛的甲醛法可引起兩個時相的疼痛［7］，0～10min出現(xiàn)者為Ⅰ相 (早期相)，10～60min出現(xiàn)的反應為Ⅱ相 (遲發(fā)相)。第1相主要是直接刺激C纖維所致，如受試藥物對此相有抑制作用則表明其作用為中樞性鎮(zhèn)痛;第2相反應主要是炎癥介質(zhì)釋放參與的疼痛反應，如藥物對此相有抑制作用則表明其作用為外周鎮(zhèn)痛。實驗結(jié)果表明，光葉娃兒藤不能延長小鼠熱板痛閾值，但能減少小鼠扭體次數(shù)，對甲醛引起疼痛的第二時相有顯著鎮(zhèn)痛作用，說明光葉娃兒藤能抑制繼發(fā)的炎性反應所導致的炎性疼痛。用二甲苯所致小鼠耳廓腫脹法及甲醛致小鼠足跖腫脹法觀察其抗炎作用，結(jié)果顯示，光葉娃兒藤高和低劑量組對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹和甲醛致小鼠足腫脹及足組織中PGE2含量均有顯著抑制作用，說明其對急性非特異性炎癥有明顯的抑制作用。綜上所述，光葉娃兒藤水提取物可能是通過抑制炎癥介質(zhì)釋放達到鎮(zhèn)痛抗炎作用。

［1］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草 (6)［M］.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，1999:5733.

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［5］李儀奎.中藥藥理實驗方法學［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:753－765.

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