陰溝腸桿菌引起碳青霉烯類抗菌藥物耐藥及傳播的機制研究進展

沈一芳 綜述，葉光勇 審校（浙江大學附屬婦產科醫(yī)院檢驗科，杭州 310006）

陰溝腸桿菌耐藥機制十分復雜，且多種耐藥機制可協(xié)同作用，造成陰溝腸桿菌耐藥水平高及多重耐藥的現(xiàn)象。作者對AmpCβ內酰胺酶（AmpC）、超廣譜β－內酰胺酶（ESBLs）、碳青霉烯酶的產生，主動外排系統(tǒng)的地位，藥物作用靶位及突變方式的差異等進行綜述，來為臨床合理用藥及探求防治陰溝腸桿菌耐藥的途徑提供依據(jù)。

1 碳青霉烯酶的產生

碳青霉烯酶是指對亞胺培南、美洛培南等碳青霉烯類抗菌藥物有較強水解作用的一類β內酞胺酶?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶屬于Ambler分子分類中的A、B、D類。B類為金屬酶，A、D類為絲氨酸酶，在腸桿菌科細菌中，主要的是A類酶和B類酶組成。碳青霉烯酶編碼基因可以由染色體介導，染色體介導很少在不同的菌屬間傳播；也可以定位在質粒、整合子等可轉移的基因元件上，通過質?；蜣D座子在不同菌種間傳播。

1.1 A類碳青霉烯酶 Nmc－A是第一個被證實的碳青霉烯酶。在1990年分離的1株陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，該菌來自1例已接受亞胺培南治療的法國患者?？死S酸對Nmc－A的抑制作用最強，其次是三唑巴坦，舒巴坦最弱［1］。在bla Nmc－A基因的上游有一個LysR型調控基因，編碼調控蛋白Nmc－R，與誘導性AmpC酶amp R調控ampC的方式一致。調控AmpC酶表達的amp D基因也參與了Nmc－A的誘導，ampD突變時可同時引起amp C和nmc A超表達，使這兩種不相關的酶產生增多。亞胺培南和頭孢西丁也是Nmc－A的誘導劑［2］。IMI－1是在1984年分離的來自加利福尼亞的2株陰溝腸桿菌中得到證實，IMI－1具有與Nmc－A相似的水解特性和誘導性。三唑巴坦是IMI－1最強的抑制劑，其次是克拉維酸，舒巴坦最弱。編碼IMI－1的基因是imiA1，imiA1 DNA序列和編碼的氨基酸序列與nmc A基因和其編碼的氨基酸序列的同源性大于95%；而且imiA1的上游有一個開放閱讀框架，為imiR1，與nmcR的開放閱讀框架比較，有95%同源，其編碼的蛋白質與NmcR蛋白也有95%相同，同屬LysR型調控蛋白。因此IMI－1的調控與Nmc－A相似，亞胺培南和頭孢西丁對其也有誘導性［3］。

1.2 B類碳青霉烯酶（金屬酶） VIM金屬酶是最具有臨床意義的碳青霉烯酶，多見于銅綠假單胞菌等非發(fā)酵革蘭陰性菌。在韓國1例肝硬化患者腹水中分離的陰溝腸桿菌發(fā)現(xiàn)金屬β內酰胺酶VIM－2，1株來自意大利的陰溝腸桿菌也分離出轉移性質粒編碼的VIM－4金屬酶。VIM金屬酶在陰溝腸桿菌中的出現(xiàn)說明陰溝腸桿菌對碳青霉烯類的耐藥已不可忽視［4］。

IMP－1于1991年在日本的銅綠假單胞菌中被發(fā)現(xiàn)。此后，IMP－1進一步播散到腸桿菌科中的其他多個菌屬和菌種，包括肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、弗勞地檸檬酸桿菌、大腸埃希菌、普通變形桿菌、產酸克雷伯菌、雷氏普羅威登斯菌、摩根摩根菌、福氏志賀菌等，除了IMP－1之外，還檢測到IMP－3和IMP－6。產IMP腸桿菌科細菌流行的另外兩個主要的國家和地區(qū)是澳大利亞（肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、無丙二酸鹽檸檬酸桿菌、粘質沙雷菌）和中國臺灣（肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和大腸埃希菌）［5-10］。

2 藥物作用靶位的改變

細菌的DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ是氟喹諾酮藥物的作用靶位，對于革蘭陰性菌，DNA旋轉酶是主要作用靶位。DNA旋轉酶由2個A亞基和2個B亞基組成，分別有gyr A和gyrB編碼。拓撲異構酶Ⅳ由2個C亞基和2個E亞基組成，分別有parC和par E編碼。李巖等［11］測定陰溝腸桿菌gyr A和parC基因序列發(fā)現(xiàn)，對喹諾酮敏感的陰溝腸桿菌中，gyr A和parC不會導致Gy2r A和ParC氨基酸的突變；而在喹諾酮類耐藥株中，gyr A的核苷酸突變，使Gyr A第83位絲氨酸變?yōu)楸奖彼峄蚶野彼帷Ｒ恍┠退幩捷^高的菌株還伴有Gyr A第87位天冬氨酸被丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸或天冬酰胺取代，ParC的第80位絲氨酸被異亮氨酸取代，第84位谷氨酸被谷氨酰胺或賴氨酸取代。因此Gyr A第83位絲氨酸和87位天冬氨酸是耐喹諾酮類陰溝腸桿菌的突變位點，Gyr A第83位絲氨酸發(fā)生的單氨基酸改變就可使菌株對喹諾酮的敏感性下降，且Gyr A改變的蓄積與喹諾酮類耐藥性的增加有關，ParC改變可在Gyr A改變的基礎上進一步提高對喹諾酮類的耐藥性。李麗和田磊［12］發(fā)現(xiàn)耐喹諾酮類陰溝腸桿菌Gyr A第83位絲氨酸還可突變?yōu)楫惲涟彼峄蛱K氨酸，但未證實Gyr A改變的蓄積與喹諾酮耐藥水平相關，而認為Gyr A第83位絲氨酸突變就可引起對喹諾酮高度耐藥。由于關于陰溝腸桿菌喹諾酮類藥物作用靶位改變的研究較少，且觀察的臨床分離菌株數(shù)不多，臨床分離菌的地理分布也較單一，缺乏廣泛的代表性，因此尚不能說明不同國家、地區(qū)之間突變方式有無差異，以及DNA旋轉酶的Gyr B亞基和拓撲異構酶Ⅳ的Par E亞基的改變與陰溝腸桿菌的喹諾酮類耐藥性是否相關。

3 外膜通透性下降

陰溝腸桿菌外膜上至少有兩種膜孔蛋白F和D。缺乏膜孔蛋白F、D和膜孔蛋白F的陰溝腸桿菌與膜孔蛋白正常的菌株比較，對諾氟沙星的蓄積均約減少1／2，使諾氟沙星的MIC上升，認為氟喹諾酮主要利用膜孔蛋白F迅速地穿過陰溝腸桿菌外膜，膜孔蛋白D在氟喹諾酮的轉運中僅發(fā)揮微弱作用。但兩種膜孔蛋白均缺失的菌株也有低水平的諾氟沙星蓄積，說明在氟喹諾酮轉運過程中，還有一條不依賴于膜孔蛋白，而通過脂多糖的Mg2＋敏感性“自我啟動”的轉運途徑。β－內酰胺類抗菌藥物如頭孢吡肟也通過膜孔蛋白F進入陰溝腸桿菌胞內。因此當兩類藥物同時存在時，兩者競爭膜孔蛋白F進入菌體內，競爭力的大小取決于藥物分子大小、表面電荷的位置與方向等參數(shù)。聚胺如精胺，可使膜孔蛋白關閉，當存在精胺時，菌株對諾氟沙星的蓄積減少，并且隨著精胺濃度的上升，減少的幅度越大。因此細菌在一些外界因子如p H調控下產生的精胺，如尸胺，可關閉膜孔蛋白減少菌株對β內酰胺類和氟喹諾酮的蓄積，使細菌逃避抗菌藥物的殺滅作用，這開辟了研究陰溝腸桿菌耐藥機制的一個新領域［13］。在銅綠假單胞菌和大腸埃希菌中碳青霉烯類通過一條特異的膜孔蛋白通道穿過菌體外膜，但在陰溝腸桿菌中，沒有對碳青霉烯類特異的膜孔蛋白。外膜蛋白的改變對亞胺培南和美洛培南的影響不全相同。在陰溝腸桿菌中，美洛培南滲透入細菌的速率是亞胺培南的2倍。外膜蛋白OmpC和Omp F的缺失，使美洛培南滲透入細菌的速率下降20倍，而同樣條件下亞胺培南僅下降7倍。因此陰溝腸桿菌對美洛培南的敏感性較亞胺培南更多地依賴外膜通透性［14］。

4 主動外排活躍

關于陰溝腸桿菌主動外排系統(tǒng)的研究很少，但研究已證實陰溝腸桿菌染色體上存在Acr AB基因，編碼Acr AB多藥外排系統(tǒng)。Acr AB外排泵的底物非常廣泛，包括氯霉素、四環(huán)素、新生霉素、紅霉素、β內酰胺類、氟喹諾酮類、有機溶劑、膽鹽、去污劑、染料、氧化劑和甲氨等。Acr AB系統(tǒng)是細菌抵御外界不良環(huán)境及維持內環(huán)境的重要途徑，其在基礎水平表達時決定著細菌對抗微生物制劑的固有耐受性，保護細菌免受生存環(huán)境中一些有害物質的影響，在一定條件下，當其超表達時，使細菌對氟喹諾酮等多種結構不相關的抗菌藥耐藥，形成多重耐藥表型。

5 耐藥基因傳播機制

細菌獲得性耐藥可通過細菌染色體基因組的突變產生，也可通過各種可移動DNA組分，水平轉移至敏感細菌，通過位點特異性重組酶或整合酶，整合到染色體基因組，或通過質粒自身復制，使敏感細菌獲得耐藥性。其中接合和轉化是耐藥性水平傳遞的主要機制。革蘭陰性桿菌間接合傳遞是通過可接合性菌毛連接供體菌和受體菌，遺傳物質通過菌毛，從供體菌直接進入受體菌?？山雍系倪z傳物質有：可接合性質粒、可接合的轉座子和一些整合性可接合成分。

轉座子（Tn），亦稱跳躍基因，是指能將自身基因插入基因組中任何一個在序列上與己無關的新位點的DNA序列，分為復合轉座子和復雜轉座子。細菌轉座子可攜帶各種耐藥基因，獲得性耐藥和突變耐藥是細菌的兩個不同的耐藥機制，獲得性耐藥是指細菌借助于可移動遺傳元件獲得耐藥基因，醫(yī)院感染病原菌以此類耐藥機制常見。

整合子是細菌特別是革蘭陰性菌基因中，一種能識別且俘獲移動性基因盒，并有位點特異性的重組表達系統(tǒng)。它可以通過存在于質粒、轉座子等可移動基因元件在同種菌屬和不同種菌屬中進行基因的水平轉移，從而使細菌的耐藥性得以傳播。整合子由5′和3′保守末端及中間的可變序列組成，5′保守末端攜帶編碼整合酶的基因intI、重組位點attI和一個啟動子的基因片段，中間的可變區(qū)域攜帶有耐藥基因的基因盒，一個基因盒由一個耐藥基因和其下游的attC位點組成，attC位點可被整合酶識別的特異性整合位點，為耐藥基因的插入和表達提供了重要的基礎。整合子根據(jù)整合酶基因序列不同而分類，目前發(fā)現(xiàn)的整合子分為6類，公開報道的僅有4類。Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類整合子與細菌的耐藥有關。最常見的是Ⅰ類整合子，它的整合酶是含有337個氨基酸的蛋白，5′－保守端有編碼整合酶的intI基因及啟動子，大多數(shù)3′－保守端有3個開放讀碼框（open reading frame，ORF），即季銨鹽化合物及溴化乙錠的耐藥基因（qacEΔ1）、磺胺耐藥基因（sulI）、功能不明的 ORF5［3］。Ⅱ、Ⅲ類整合酶與Ⅰ類整合酶相比分別有46%、61%的同源性［15］。整合子是耐藥基因擴增的一種新機制，在整合酶的催化下，于59 bp的特定位點上識別并整合耐藥基因盒。

整合子與陰溝腸桿菌的多重耐藥性整合子作為一種可移動基因元件，通過整合酶的作用可特異性地俘獲和表達外來的移動性基因盒。作為一種天然克隆和表達的載體，它能夠以質粒或轉座子為載體在細菌間進行基因的水平移動，從而使細菌的耐藥基因得以迅速和廣泛傳播。南韓學者在一株臨床分離的陰溝腸桿菌中發(fā)現(xiàn)含有VIM－2和aad A基因盒的整合子；在希臘的一株臨床陰溝腸桿菌分離菌株中發(fā)現(xiàn)I類整合子含有blaVIM－1和aac（6）－Ⅱc基因［16］，陰溝腸桿菌I類整合子中也發(fā)現(xiàn)含有其他基因盒，如IBC－1和aac（6）－Ib等。在陰溝腸桿菌中同時發(fā)現(xiàn)含有β內酰胺酶和氨基糖苷類修飾酶基因盒，表明多重耐藥形勢嚴峻。

綜上所述，陰溝腸桿菌耐藥機制復雜，且多種耐藥機制可協(xié)同作用，多重耐藥形勢日益嚴峻，控制其感染、流行和傳播面臨新的威脅和挑戰(zhàn)。因此仍需對許多問題，如AmpC酶、ESBLs、青霉烯酶的產生，主動外排系統(tǒng)的地位，藥物作用靶位及突變方式的差異等進行深入的研究，為臨床合理用藥及探求防治陰溝腸桿菌耐藥的途徑提供依據(jù)。

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