間充質(zhì)干細胞治療椎間盤退行性變的研究進展

李 超，李 明

腰痛是臨床常見病之一，據(jù)統(tǒng)計約有85%的人一生中會出現(xiàn)該癥狀，是45歲以上的人喪失勞動能力的主要原因之一。椎間盤退行性疾病(disc degeneration disease，DDD)是腰痛主要的原因之一。傳統(tǒng)的脊柱融合的治療方法能夠有效地緩解疼痛，但會導(dǎo)致脊柱活動度的下降和鄰近椎間盤的退變。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)移植治療腰椎退行性疾病作為新型的治療手段，與傳統(tǒng)方法相比有很多優(yōu)勢，在基礎(chǔ)與臨床研究方面都取得了很大的進展。

1 DDD的病理改變

DDD作為與年齡密切相關(guān)的疾病，目前的確切病因尚不清楚。各種病因，如年齡、遺傳因素、吸煙等［1］共同作用，導(dǎo)致了椎間盤的病理變化。①細胞種類的改變:終板多由圓形的軟骨樣細胞構(gòu)成，而纖維環(huán)多由狹長的軟骨樣細胞構(gòu)成，這兩部分的細胞成分較少變化。未成熟的髓核中存在部分脊索細胞，相對于其他細胞而言，有著更強的分泌蛋白聚糖與Ⅱ型膠原的能力，隨著年齡的增長(約4～10歲)逐漸被軟骨樣的細胞替代，脊索細胞的消失被認為是椎間盤退變的重要原因之一［2］。②細胞老化壞死與細胞凋亡:Le Maitre等［3］發(fā)現(xiàn)在退化的椎間盤中P16INK4A，β半乳糖苷酶等細胞老化的標志物表達上升，同時細胞的增值能力下降。隨著細胞的老化與營養(yǎng)供應(yīng)的不足，椎間盤的微環(huán)境出現(xiàn)變化，包括氧分壓、PH值、自由基的增加等［4］，微環(huán)境的改變誘導(dǎo)了細胞的壞死與凋亡。據(jù)報道，退變的椎間盤壞死的細胞比例可高達50%［5］。③細胞表達的變化:退變的椎間盤細胞蛋白合成結(jié)構(gòu)與生長因子等均發(fā)生了改變，如Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型膠原纖維與白細胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-1-RI含量的增加，Ⅱ、Ⅸ型膠原纖維、蛋白聚糖、IL-1-Ra含量的降低［6］，細胞外基質(zhì)表達減少。特別是Ⅰ/Ⅱ型膠原蛋白比例的上升和蛋白聚糖、基質(zhì)含量的減少，被認為是DDD特征性的病理變化之一。上述細胞組織在病理狀態(tài)下的改變最終導(dǎo)致椎間盤水含量的降低，凝膠狀髓核逐漸干裂，加之外層纖維環(huán)張力的下降，最終導(dǎo)致了椎間盤高度的下降、纖維環(huán)的破裂和髓核的疝出。

2 MSC的特點

MSC是來自于未成熟的胚胎結(jié)締組織的多能干細胞，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。在人的骨髓中，MSC的密度約為百萬分之一到萬分之一，其免疫表型表現(xiàn)為CD29+，CD44+，CD71+，CD90+，CD106+，CD14－，CD4－，CD45－，HLA-Ⅱ陰性。MSC移植應(yīng)用于治療DDD有其自身的優(yōu)勢:①MSC來源廣泛，存在于骨髓、脂肪等間質(zhì)組織，相對于自身椎間盤髓核細胞(nucleus pulposuscell，NPC)移植而言，其提取不會損傷椎間盤，易于提取和培養(yǎng)增殖。②退化的椎間盤中的組織基因表達改變，合成Ⅱ型膠原與蛋白聚糖的能力下降，MSC不存在此問題。③MSC存在自我復(fù)制和分化的能力，相對于成熟細胞，MSC更易于誘導(dǎo)分化。④MSCHLA-Ⅱ型抗原陰性，免疫反應(yīng)較弱，為同種異體移植提供了可能。

3 MSC分化的誘導(dǎo)

3.1 生物支架

生物支架能夠模擬椎間盤的微環(huán)境，提高MSC移植效率。Merceron等［7］提出生物支架必須兼?zhèn)渖锝M織相容性，體內(nèi)降解能力，三維的內(nèi)部構(gòu)像，合適的機械強度等條件。目前常用的有藻酸鹽凝膠、聚氨基葡萄糖凝膠、藻酸丙二醇酯、膠原海綿等多種，哪種支架能夠提供最佳的生物學效果目前尚無定論［4］。Gruber等［8］對比了膠原海綿、膠原凝膠、瓊脂糖、藻酸鹽，發(fā)現(xiàn)膠原海綿支架有著良好的誘導(dǎo)細胞增殖與基因表達能力，但是盡管膠原凝膠支架中的細胞增殖能力最強，其合成基質(zhì)的能力較低，限制了其應(yīng)用。Richardson等［9］報道了復(fù)合左旋乳酸支架能夠誘導(dǎo)MSC向椎間盤中NPC分化，隨后的研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖-甘油磷酸酯凝膠可誘導(dǎo)MSC向軟骨樣細胞分化，并表達膠原與蛋白聚糖。Vinatier等［10］通過動物實驗證實了水凝膠類支架有著良好的效果，其誘導(dǎo)效果與其他支架相近，其可注射的特點使其在臨床應(yīng)用中有著更廣闊的前景。

3.2 MSC培養(yǎng)的微環(huán)境

正常人體組織中椎間盤的環(huán)境可以誘導(dǎo)MSC細胞向NPC分化，其作用與通過膠原等大分子和MSC膜表面的信號通路接觸有關(guān)，目前認為NPC的存在可以誘導(dǎo)MSC細胞向NPC分化，而MSC也可促進NPC自身的修復(fù)與表達。Allon等［11］將 MSC與NPC共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MSC在保持自身數(shù)量的同時存在向軟骨樣細胞分化的現(xiàn)象，其結(jié)構(gòu)全部為外層的軟骨樣細胞包裹內(nèi)層的MSC細胞，并在培養(yǎng)基中呈微衛(wèi)星放射樣分布。Sobajima等［12］將MSC與NPC按照不同的比例混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)NPC與MSC比例為75∶25或50∶50時培養(yǎng)基產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)含量最高。MSC培養(yǎng)的物理環(huán)境，如低氧、PH值等可誘導(dǎo)MSC向能夠分泌蛋白聚糖及基質(zhì)的軟骨樣細胞分化。Felka等［13］通過MSC的體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)低氧能夠誘導(dǎo)MSC向軟骨樣細胞分化，并增加細胞外基質(zhì)的分泌。Wuertz等［14］提取兔MSC在體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境可抑制MSC的分化與增殖。

3.3 細胞因子

細胞因子可以調(diào)節(jié)MSC的增殖、分化和基質(zhì)的合成［15］，Steck 等［16］提取人 MSC 在含轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGT-β)藻酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TGF-β可促進MSC表達轉(zhuǎn)錄因子9分泌，并提高膠原與聚糖蛋白的表達。Yang等［17］將54只椎間盤損傷模型兔隨機分為3組，分別予纖維凝膠-MSC-TGF-β1、纖維凝膠-TGF-β1 及空白對照處理，發(fā)現(xiàn)第1組可有效減緩?fù)米甸g盤退變。IGF-1可以誘導(dǎo)MSC向軟骨組織的分化，Ehlicke等［18］在體外以不同細胞因子誘導(dǎo)MSC向NPC分化3周，以熒光免疫法檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纖維生長因子-2(fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF-2)，血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)有誘導(dǎo)MSC分化與基質(zhì)合成的作用。Shen等［19］以 TGF-β3 同骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)誘導(dǎo)MSC分化，發(fā)現(xiàn)TGF-β3明顯增加蛋白聚糖及Ⅱ型膠原的表達，而這一作用可被BMP-2加強。Chiou等［20］的研究發(fā)現(xiàn)FGF-2可能通過MAPK信號旁路誘導(dǎo)MSC向軟骨樣細胞分化。Imai等［21］將人NPC在含重組人成 骨 蛋 白-1(recombination human osteegenic protein-1，rhOP-1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，發(fā)現(xiàn)rhOP-1可促進細胞增殖與產(chǎn)物表達。在MSC與NPC共培養(yǎng)的過程中，MSC與NPC可相互促進這些細胞因子的分泌，并以此誘導(dǎo)MSC向NPC分化、NPC的增殖及產(chǎn)物的表達。

4 MSC體內(nèi)植入研究

Zhang等［22］報道了MSC與髓核細胞混合培養(yǎng)后植入山羊椎間盤退變模型中，經(jīng)過6個月后發(fā)現(xiàn)實驗組椎間盤中蛋白聚糖濃度較對照組(只注入培養(yǎng)基)高45%。Yang等［17］將家兔椎間盤退變模型分為MSC-TGF-β1聯(lián)合注入組，單純 TGF-β1注入組和空白組，結(jié)果顯示相對于單純TGF-β1注入組，MSC有效減緩椎間盤退變，膠原及蛋白多糖的積聚明顯多于空白組與單純 TGF-β1注入組。Sakai等［23］在家兔退變椎間盤模型制成2周后，分別移植入MSC，24周后檢查正常椎間盤、模擬手術(shù)椎間盤和移植后椎間盤的X線片椎間盤高度、MRI T2信號的改變，組織學、免疫組織化學和基質(zhì)關(guān)聯(lián)的基因表達。結(jié)果顯示移植MSCs組椎間盤的高度為正常對照組的91%、T2信號強度為正常對照組81%，免疫組織化學和基因表達分析有蛋白多糖積聚。而模擬手術(shù)椎間盤只有正常對照組的61%和60%。Crevensten等［24］將白鼠異體MSC以透明質(zhì)酸凝膠為支架注入尾骨椎間盤內(nèi)，單獨注射凝膠為對照組。2周后以免疫熒光法可觀察到存活MSC細胞，4周后發(fā)現(xiàn)實驗組椎間盤較對照組有增高趨勢。Sobajima等［12］以 β-半乳糖苷酶標記兔 MSC，分別注入12只兔L2/L3/L4/L5髓核內(nèi)，在3周、6周、12周及24周觀察干細胞情況，發(fā)現(xiàn)24周時MSC存活良好，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，并且在周圍纖維環(huán)中觀測到MSC的存在。Wang 等［25］對獼猴 L3/L4、L5/L6椎間盤摘除術(shù)后，隨機分組做陶瓷椎間盤、自體髂骨移植融合及骨髓MSC陶瓷混合融合等3種替代治療，3個月分析融合及基質(zhì)、膠原產(chǎn)生情況，結(jié)果顯示混合組融合最佳，相對于其他2組膠原與蛋白聚糖的積累有顯著差異。Hiyama等［26］將犬分為不作處理對照組，髓核摘除組和MSC組，其中MSC組在髓核摘除4周后給予MSC注入，12周后觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MSC組椎間盤退變較其他組緩慢，其作用可能是通過表達人凋亡相關(guān)因子配體以維持髓核免疫豁免狀態(tài)。Yang等［27］將異體鼠MSC注入鼠退變椎間盤內(nèi)，觀察12周，發(fā)現(xiàn)NPC蛋白聚糖基因表達上調(diào)，而原位雜交與免疫組化分析可發(fā)現(xiàn)MSC向NPC分化的現(xiàn)象，證實MSC可通過分化與增殖為NPC并促進NPC產(chǎn)物表達在體內(nèi)發(fā)揮其保護椎間盤的作用。Henriksson等［28］將椎間盤退變豬分為2組，分別給予人MSC與人MSC-水凝膠，在1個月、3個月和6個月觀察，MRI發(fā)現(xiàn)所有椎間盤均出現(xiàn)退變，但人MSC-水凝膠組退變較慢，證實水凝膠類在機體內(nèi)仍可發(fā)揮其促進MSC分化與基因表達的作用，同時探討了異種MSC用于治療DDD的可能性。Wei等［29］將熒光標記人MSC分為CD34+組與CD34－組注入鼠尾骨椎間盤，42 d后發(fā)現(xiàn)MSC存活情況良好，在21 d后發(fā)現(xiàn)CD34－組MSC存在向NPC分化現(xiàn)象，而CD34+無此現(xiàn)象，且在所有椎間盤內(nèi)均無炎細胞的聚集，證實異種MSC可存活、分化、表達且有免疫豁免。由于MSC治療DDD開展時間相對較短，其安全性尚有待進一步驗證，臨床報道的人體實驗很少。Yoshikawa等［30］報道了2名腰椎椎管狹窄合并椎間盤退行性變的病例，在髂骨取MSC在體外含自體血清的培養(yǎng)基增殖后，以膠原海綿為支架植入退化椎間盤內(nèi)，2年后行MRI檢查，椎間盤無退化跡象。

應(yīng)用MSC治療DDD，針對病因治療，避免了傳統(tǒng)治療手段脊椎活動受限、相鄰節(jié)段椎間盤退變等并發(fā)癥，在動物實驗中已取得了良好的效果，擁有廣闊的臨床應(yīng)用前景［31］。然而，還有許多問題亟待解決:①細胞因子與髓核細胞誘導(dǎo)MSC分化的機制及分子生物學基礎(chǔ)尚不明確。②缺乏嚴密設(shè)計的人體相關(guān)試驗，臨床安全性未得到評估。③MSC移植作為治療手段，在臨床應(yīng)用的時機有待確定。相信在醫(yī)務(wù)工作者的不懈努力下，這些問題不日將得到解決，MSC將在治療椎間盤退變性疾病方面發(fā)揮更大的作用。

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