納米支架在組織工程中的研究進展

鐘小忠， 李佳楠

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430056）

骨缺損是臨床上的常見病， 也是骨科治療的難題之一。 骨組織因其自身組織結(jié)構(gòu)的生長特性， 一旦發(fā)生大面積缺損、 骨不連、 骨組織萎縮、骨折、 愈合不良等病變后， 難以再生修復(fù)， 給患者帶來極大痛苦。 自體骨移植目前是治療骨缺損的黃金標(biāo)準(zhǔn)， 然而自體骨移植需要通過額外的手術(shù)來獲得移植骨， 往往給患者帶來巨大的痛苦，手術(shù)感染率也極高， 并且來源有限。 作為另一種選擇， 異體骨移植雖然來源豐富， 但存在著免疫排斥、 晚期感染、 移植骨愈合緩慢以及可能導(dǎo)致交叉感染等問題［1］。 組織工程學(xué)則為研究人員解決這些問題提供了新的思路。 組織工程學(xué)是研究開發(fā)能夠用于修復(fù)、 維持或改善損傷組織功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學(xué)科。

組織工程學(xué)的研究主要有3 個要素［2］： 細(xì)胞是一切生物組織最基本的結(jié)構(gòu)單位； 支架是用于支撐細(xì)胞成長為一個完整的組織的框架材料； 生長因子用于影響細(xì)胞活動。 在骨組織工程中， 研究的主要方向在于如何構(gòu)建三維支架， 提供一個微環(huán)境 （人工合成的臨時細(xì)胞外基質(zhì)ECM）， 以供細(xì)胞吸附、 增殖、 分化， 然后形成新的組織。因此， 支架材料的選擇對于新生組織的形成非常重要。 良好的支架材料必須具有生物可降解性， 且降解的速率要同新組織的形成同步， 以便留出足夠的空間供新生組織生長。 同時支架材料及其降解產(chǎn)物都必須具有良好的生物相容性。 納米材料以其超微的結(jié)構(gòu)、 良好的生物相容性及較廣泛的生物學(xué)活性等優(yōu)勢， 近年來逐漸成為組織工程研究的優(yōu)先選擇材料。

納米結(jié)構(gòu)通常指尺寸在1 ～100 nm 范圍的微小結(jié)構(gòu)， 比微米結(jié)構(gòu)小上千倍。 當(dāng)納米粒子的表面原子數(shù)與總原子數(shù)之比隨粒徑變小而急劇增大后， 會引起性質(zhì)上的變化。 由于納米粒子表面原子數(shù)增多， 表面原子配位數(shù)不足及高的表面能，使這些原子易與其他原子相結(jié)合而穩(wěn)定下來， 故具有很高的化學(xué)活性。 而且納米纖維具有與天然ECM 相近的微觀結(jié)構(gòu)， 使制備的支架能夠模仿天然ECM 的結(jié)構(gòu)特點； 極高的比表面積也為活性因子的有效釋放提供了理想平臺。 因而納米纖維有望被制成理想的組織工程支架。

1 納米纖維支架材料的特性

支架作為一個臨時ECM， 給細(xì)胞提供了再生的環(huán)境， 因此必須模擬天然ECM 的有利特性。與天然ECM 不同的是， 組織工程設(shè)計的支架不但要提供組織生長的空間， 還需具備加速組織再生的能力。 因此人工設(shè)計的支架主要是將能加速組織再生的特性（如孔隙率、 孔徑、 孔間連接等）進行最優(yōu)化的組合。 筆者討論支架材料的兩個主要特性， 即生物可降解性以及結(jié)構(gòu)特性。

1.1 生物可降解性

醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中， 生物可降解性被理解為在機體生理條件下， 通過水解、 酶解， 從大分子物質(zhì)降解為對機體無害的小分子物質(zhì)， 或者小分子物質(zhì)在機體內(nèi)自行降解， 最后通過機體的新陳代謝完全吸收和排泄， 對機體不產(chǎn)生毒副作用［3］。 在組織工程中， 支架材料的生物可降解性是必須的，并且其降解的速率應(yīng)與組織再生的速率同步， 從而實現(xiàn)支架的模板功能。 一些合成的線性脂肪族聚酯擁有良好的生物相容性及生物可降解性， 如聚乳酸（PLA）、 聚羥基乙酸（PGA）、 乳酸－羥基乙酸共聚物（PLGA）等。 它們常常被用作構(gòu)建支架的聚合物［4－6］。 聚乙烯（PEG）不具備生物可降解性， 但是作為一種優(yōu)秀的生物相容性水凝膠材料， 其機械特性類似于一些軟組織， 如軟骨［7］。Han 等［8］將PEG 與PLA、 PGA 或PLGA 混合成為共聚物， 彌補了其不可降解之不足。

另一種獲得生物可降解性材料的方法是在聚乙烯的基礎(chǔ)上， 合成一種可供金屬蛋白酶（MMPs）降解的共聚物［9］。 這種方法是模仿天然ECM 中的膠原蛋白以及其他成分可以被酶降解的特性。 這些共聚物能夠聚合形成交聯(lián)的水凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)， 進一步又可以被細(xì)胞分泌的MMPs降解。

1.2 結(jié)構(gòu)特性

當(dāng)生物支架被植入機體后， 要能提供一定的機械強度和結(jié)構(gòu)來支持新組織的形成。 因此， 生物支架除了具備高效的生物活性以外， 還必須擁有一些關(guān)鍵的形態(tài)特征。 多孔性是支架構(gòu)建過程中的一個重要因素， 多孔結(jié)構(gòu)有利于促進細(xì)胞的分布并且引導(dǎo)組織的生長。 具有多孔結(jié)構(gòu)的材料， 孔隙率越高， 越有利于細(xì)胞在材料表面爬行、 附著、 生長和繁殖， 同時也利于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸。 Oh 等［10］將PLGA 和聚己酸內(nèi)酯（PCL）混合構(gòu)建了一個多孔結(jié)構(gòu)支架， 該支架不僅可以提高蛋白裝載能力， 還能得到可控的降解速率。 多孔結(jié)構(gòu)材料孔徑的大小也非常重要， 它要能提供一個最優(yōu)化的表面積， 以供細(xì)胞吸附。 當(dāng)孔徑太小時， 就會抑制細(xì)胞的遷移， 導(dǎo)致細(xì)胞壞死［11］。 而當(dāng)孔徑過大時， 將不能提供足夠的表面積讓細(xì)胞吸附［12］。 因此在設(shè)計多孔支架時， 要從多方面的參數(shù)考慮， 如孔形態(tài)、 孔間連接以及整體的通透性等。

2 納米纖維支架構(gòu)建技術(shù)

天然ECM 中， 很多蛋白都是纖維結(jié)構(gòu)， 具有納米級的直徑。比如膠原， 作為人體ECM 中含量最豐富的蛋白， 是由直徑50～500 nm 的纖維束構(gòu)成的纖維結(jié)構(gòu)。 雖然現(xiàn)在開發(fā)出了大量的技術(shù)用來構(gòu)建支架， 但是將纖維結(jié)構(gòu)控制在納米級的技術(shù)主要有3 種： 電紡絲技術(shù)、 自組裝技術(shù)以及熱致相分離技術(shù)。

2.1 電紡絲技術(shù)

電紡絲技術(shù)的產(chǎn)生已經(jīng)有100 多年［13］， 在應(yīng)用于組織工程構(gòu)建納米纖維支架以前主要是用來生產(chǎn)工業(yè)產(chǎn)品［14］。 電紡絲是一種將聚合物溶液在強電場作用下形成噴射流， 然后在搜集器上產(chǎn)生納米級或微米級的纖維的技術(shù)［15］。 由于使用簡單， 并且能使用多種材料產(chǎn)生納米纖維， 因此這方面的研究一直是一個熱點。 一些天然大分子（如膠原蛋白、絲心蛋白以及纖維蛋白原等）和人工合成的聚合物（如PGA、PLLA、PLGA、PCL 等）已經(jīng)通過這種技術(shù)來構(gòu)建納米纖維支架。 纖維的直徑可以通過改變?nèi)芤旱臐舛葋碚{(diào)整， 濃度越高的溶液產(chǎn)生的纖維直徑越大。 然而， 電紡絲技術(shù)產(chǎn)生的是二維的片狀結(jié)構(gòu)， 三維體系則是將二維的片狀結(jié)構(gòu)層疊起來， 因此很難產(chǎn)生良好的多孔性和復(fù)雜的幾何結(jié)構(gòu)［16］。 目前Moroni 等［17］嘗試著將電紡絲與3D 印刷技術(shù)結(jié)合起來， 并成功構(gòu)建了3D 沉降的粗纖維和電紡絲提供的微纖維交錯的支架， 但是在這方面的研究還有待深入。

2.2 自組裝技術(shù)

分子自組裝是普遍存在于自然界的一種現(xiàn)象， 可以描述為自發(fā)的、 非外力引導(dǎo)的、 將單個實體有機地組織成具有有序結(jié)構(gòu)的有機整體［18］。對分子自組裝的定義是：在熱力學(xué)平衡的條件下，由于一系列非共價鍵力 （包括氫鍵、 離子鍵、 范德華力和疏水作用力） 的作用， 分子自發(fā)地有機裝配成一定結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定集合［18］。 一些生物分子，比如多肽和蛋白質(zhì)， 可以自組裝成穩(wěn)定的、 結(jié)構(gòu)清楚的層次結(jié)構(gòu)。 比如膠原分子就能自組裝成原膠原分子， 并能進一步由3 個原膠原分子組裝成直徑50～500 nm 的膠原纖維。一些寡肽通過離子自組裝可以形成由10～20 nm 直徑的纖維相互交聯(lián)而組成的水凝膠［19］。 分子自組裝形成納米纖維是一種由下而上的策略， 因此獲得的材料往往比通過電紡絲得到材料要?。?0］。 然而作為一種新興技術(shù)， 分子自組裝仍然有很大的局限性， 目前最大的問題是無法控制孔隙率和孔徑的大小； 其次便是通過分子自組裝構(gòu)建的支架在機械強度上還有一定欠缺。

2.3 熱致相分離技術(shù)

熱致相分離技術(shù)（TIPS）的原理是當(dāng)一個均相的多成分系統(tǒng)在特定條件下處于熱力學(xué)不穩(wěn)定時， 為了降低體系的自由能， 會傾向于分離而形成一個多相體系［21］。 TIPS 近年來已開始應(yīng)用于組織工程多孔支架的構(gòu)建。 在這個過程中， 當(dāng)相分離時， 聚合物溶液會分離成兩個相， 富聚合物相（高濃度聚合物）以及貧聚合物相（低濃度聚合物）。然后通過萃取、 蒸發(fā)或升華等方法除去溶劑， 富聚合物相就會固化并可形成一種開孔泡沫材料。使用不同的溶劑和聚合物、 調(diào)整聚合物的濃度或者相分離的溫度， 可以得到不同孔形態(tài)的支架。這種方法形成的纖維直徑范圍在50～500 nm，并且孔隙率高達98%， 相對于其他方法產(chǎn)生的支架來說， 擁有更高的比表面積。

將TIPS 與一些加工技術(shù)（如顆粒瀝濾技術(shù)或3D 印刷技術(shù)）結(jié)合， 可構(gòu)建具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)以及良好孔形態(tài)的支架［22］。 Zhang 等［23］將PLLATHF 聚合物的溶液滴在一個模具中的糖顆粒上，然后冷卻至預(yù)定的凝膠溫度， 在相分離以后， 將凝膠-糖復(fù)合物用蒸餾水浸過， 以除去溶劑和糖顆粒， 再將樣品冷凍干燥后， 最終制備了一個具有大孔的3D 支架。

3 納米支架的表面修飾

天然ECM 的表面可直接影響細(xì)胞應(yīng)答， 并最終影響新組織的形成速率和質(zhì)量［24］， 因此生物支架與細(xì)胞之間的相互作用就顯得非常重要。 當(dāng)前的材料所構(gòu)建的支架表面普遍缺乏生物識別能力， 因此必須通過修飾支架的表面以獲得相應(yīng)的特性來促進細(xì)胞和支架之間的相互作用。

目前已經(jīng)有多種方法可用來修飾支架表面，但其中大部分方法都只能用來修飾二維的表面或者很薄的三維結(jié)構(gòu)， 真正的三維支架的修飾仍十分困難。 Ma 等發(fā)明了一種靜電分層自組裝技術(shù)，可以用明膠來修飾PLLA 納米纖維支架［25］， 這種技術(shù)的優(yōu)點在于只要支架的孔互聯(lián)， 就可以用來修飾任何復(fù)雜的3D 支架。 細(xì)胞在被修飾后的PLLA 支架上分化能力有了明顯提高， 細(xì)胞分布率和密度也有了很大提升［25］。

4 納米支架的生物效應(yīng)

細(xì)胞的吸附、 增殖和分化對于新組織的形成是至關(guān)重要的， 而納米纖維支架可增強細(xì)胞的上述活動， 構(gòu)建有機的組織來替代受損組織。 納米支架生物效應(yīng)方面的研究目前剛剛起步， 資料十分有限。 因而筆者主要討論細(xì)胞在支架上最主要的幾種效應(yīng)。

4.1 吸附和增殖

新組織形成的第一步是細(xì)胞吸附， 然后增殖、 遷移和分化。天然ECM 是由Ⅰ型膠原蛋白和其他蛋白質(zhì)以及生物分子組成， 可為細(xì)胞提供一個基礎(chǔ)的吸附結(jié)構(gòu)［26］，供細(xì)胞吸附、遷移、增殖以及分化。 因此， 人工合成的ECM 傾向于模仿天然ECM 的這種結(jié)構(gòu)和功能。

一些整聯(lián)蛋白 （纖連蛋白、 玻連蛋白和層黏連蛋白）可以選擇性地被吸附在納米纖維支架上［27］。 這些蛋白可能與Ⅰ型膠原蛋白的結(jié)合有關(guān)， 它能讓細(xì)胞與納米纖維支架直接相互作用。成骨細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞、 大鼠腎細(xì)胞、 平滑肌細(xì)胞、 神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等多種細(xì)胞在納米纖維支架上都表現(xiàn)出極高的吸附能力［28－32］。 還有研究表明具有分支的納米纖維比線性的納米纖維具有更高的可吸附能力［33］。 這些增強的吸附能力使得納米纖維支架能更快地促進組織再生。

當(dāng)細(xì)胞吸附在支架上以后就要進行遷移以及增殖， 直到充滿整個支架后開始形成組織。 一些細(xì)胞在納米纖維支架上顯示出更高的增殖能力。Chen 等［34］將成骨細(xì)胞在納米纖維支架上培養(yǎng)7 d以后， 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目是在傳統(tǒng)支架上的3 倍。

4.2 分化

從細(xì)胞分化成具有高度特異性的組織是一個由多種因素影響的復(fù)雜過程。 目前包括成骨細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞都在納米纖維支架上表現(xiàn)出了更強的分化能力［35］。 當(dāng)未成熟的細(xì)胞開始向成骨細(xì)胞分化時， 會表達出一系列特定的蛋白， 當(dāng)開始分泌骨鈣素和骨涎蛋白時， 表達量會達到頂點。 Li 等［36］發(fā)現(xiàn)這些蛋白有利于細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞， 并且其表達量在納米纖維支架上會有明顯增加。 當(dāng)?shù)鞍妆磉_到一定程度時， ECM開始礦物化， 而在納米纖維支架上， 礦物的分布會更加均勻［34］。

在納米纖維支架上可以培養(yǎng)出分布更均勻的細(xì)胞， 以及更接近于組織的類組織單元。 Shin等［37］將體外和體內(nèi)培養(yǎng)結(jié)合起來， 產(chǎn)生了血管化、 礦物化以及嵌入的類骨細(xì)胞的骨組織。 所有這些研究都表明納米纖維支架擁有培養(yǎng)功能性、可替代骨組織的潛能。 因此， 目前的研究還需要在培養(yǎng)條件和支架設(shè)計上更加深入。

5 結(jié)語

組織工程作為一門蓬勃發(fā)展的新興學(xué)科， 對于再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展起著巨大的推動作用， 而納米纖維支架在其中扮演了十分重要的角色。 通過模仿天然ECM 的結(jié)構(gòu)和特性制備的支架材料可提高細(xì)胞和支架之間的相互作用， 增強細(xì)胞的吸附、 增殖和分化， 加快組織再生。 然而作為一種新的概念， 這方面的研究依然有待深入。 隨著各種新技術(shù)和新材料的進一步發(fā)展， 必定能設(shè)計出更加完善的支架， 以達到產(chǎn)生完美替代組織的目標(biāo)。

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